Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng – Tài liệu text

Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (563.26 KB, 37 trang )

Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
MỤC LỤC
A. MỞ ĐẦU …………………………………………………………………………………………..
B. NỘI DUNG ………………………………………………………………………………………..
1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển gen …………………………..
2. Các bước trong kỹ thuật chuyển gen ………………………………………………
3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật ……………………………………
3.1. Các phương pháp chuyển gen gián tiếp ………………………………………
3.1.1. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens ……………..
3.1.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus ……………………………………………..
3.2. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp ……………………………………….
3.2.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun) ……………………………..
3.2.2. Chuyển gen bằng xung điện (electroporation) …………………………
3.2.3. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection) ……………………………….
3.2.4. Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm …………………………………………..
3.2.5. Chuyển gen bằng phương pháp hóa học …………………………………
3.2.6. Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube) …………………….
4. Lợi ích và nguy cơ của cây trồng chuyển gen ………………………………….
4.1. Lợi ích ………………………………………………………………………………………
4.2. Nguy cơ tiềm ẩn …………………………………………………………………………
5. Những thành tựu, triển vọng chủ yếu trong tạo giống cây trồng
chuyển gen ………………………………………………………………………………………….
6. Các hướng chính trong tạo cây trồng chuyển gen …………………………..
6.1. Chuyển gen kháng sâu ……………………………………………………………….
6.2. Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ …………………………………………………
6.3. Chuyển gen tạo cây kháng virus gây bệnh …………………………………..
6.4. Chuyển gen tạo cây sản xuất protein động vật ……………………………..
6.5. Chuyển gen thay đổi hàm lượng và chất lượng các chất dinh
dưỡng của cây ………………………………………………………………………………….
6.6. Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc ……………………………….
7. Quy trình tạo hoa hồng xanh bằng kỹ thuật RNA interference

(RNAi) ……………………………………………………………………………………………….
C. KẾT LUẬN ……………………………………………………………………………………….
TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………………………………………………..
Thủy Hồng
1
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
A. MỞ ĐẦU
Một trong các kỹ thuật của công nghệ tế bào thực vật là kỹ thuật
chuyển gen. Trước đây, để tạo một giống mới các nhà tạo giống thường sử
dụng phương pháp truyền thống để tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể thực
vật tạo ra cơ thể lai mang những tính trạng mong muốn. Phương pháp này
được thực hiện bằng cách chuyển hạt phấn từ cây này sang nhụy hoa của cây
khác. Tuy nhiên phép lai chéo này bị hạn chế bởi nó chỉ có thể thực hiện
được giữa các cá thể cùng loài (lai gần), lai giữa những cá thể khác loài (lai
xa) thường bị bất thụ do đó không thể tạo ra con lai được. Tuy nhiên, lai gần
cũng phải mất nhiều thời gian mới thu được những kết quả mong muốn và
thông thường những tính trạng quan tâm lại không tồn tại trong những loài
có họ hàng gần nhau.
Kể từ năm 1984, là lúc người ta bắt đầu tạo được cây trồng chuyển
gen và đến nay đã có những bước tiến lớn. Nhiều cây trồng quan trọng
chuyển gen ra đời như lúa, ngô, lúa mì, đậu tương, bông, khoai tây, cà chua,
cải dầu, đậu Hà Lan, bắp cải… Các gen được chuyển là gen kháng vi sinh
vật, virus gây bệnh, kháng côn trùng phá hại, gen có khả năng sản xuất
những loại protein mới, gen chịu hạn, gen kháng thuốc diệt cỏ… Kỹ thuật
chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một loài cây trồng
những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau,
không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau.
Phương pháp hữu hiệu này cho phép các nhà tạo giống thực vật thu được
giống mới nhanh hơn và vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giống
truyền thống.

Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen là kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạn
ADN, ARN) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế
Thủy Hồng
2
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
bào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen của tế
bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu,
gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của
những cơ thể chuyển gen.
Nhìn chung, việc ứng dụng cây chuyển gen đã có những lợi ích rõ rệt
như sau:
– Tăng sản lượng
– Giảm chi phí sản xuất
– Tăng lợi nhuận nông nghiệp
– Cải thiện môi trường
Những cây chuyển gen “thế hệ thứ nhất” đã giúp giảm chi phí sản
xuất. Ngày nay, các nhà khoa học đang hướng đến việc tạo ra những cây
chuyển gen “thế hệ thứ hai” nhằm tăng các giá trị dinh dưỡng hoặc có những
đặc điểm thích hợp cho công nghiệp chế biến. Lợi ích của những cây trồng
này hướng trực tiếp hơn vào người tiêu dùng. Chẳng hạn như:
– Lúa gạo giàu vitamin A và sắt
– Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột
– Vacxin thực phẩm (edible vaccine) ở ngô và khoai tây
– Những giống ngô có thể trồng được trong điều kiện nghèo dinh
dưỡng
– Dầu ăn có lợi cho sức khỏe hơn từ đậu nành và cải dầu
Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm cũng có những nguy cơ tiềm ẩn
trong việc phát triển những kỹ thuật mới. Bao gồm:
– Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc
làm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm

– Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ
hoang dại
Thủy Hồng
3
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
– Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra
từ cây chuyển gen
– Nguy cơ những chất độc này tác động tới các sinh vật không phải là
loại sinh vật cần diệt, vì thế có thể làm mất cân bằng sinh thái
Nhìn chung, mặc dù còn những điểm còn chưa rõ ràng về cây chuyển
gen nhưng với khả năng tạo ra những giống cây trồng mới có giá trị kinh tế,
công nghệ này có vai trò không thể phủ nhận được. Tuy vậy, vẫn còn một số
vấn đề đáng lo ngại. Để giải quyết những vấn đề này thì những kết luận thu
được phải dựa trên những thông tin tin cậy và có cơ sở khoa học.
Triển vọng của công nghệ chuyển gen thực vật là rất lớn, cho phép tạo
ra các giống cây trồng mang đặc tính di truyền hoàn toàn mới, có lợi cho con
người mà trong chọn giống thông thường phải trông chờ vào đột biến tự
nhiên, không thể luôn luôn có được. Đối với sự phát triển của công nghệ
sinh học trong thế kỷ XXI thì công nghệ chuyển gen sẽ có một vị trí đặc biệt
quan trọng. Có thể nói công nghệ chuyển gen là một hướng công nghệ cao
của công nghệ sinh học hiện đại phục vụ sản xuất và đời sống.
Thủy Hồng
4
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
B. NỘI DUNG
1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển gen
Khi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý
một số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen như sau:
– Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng (totipotency)
– Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập

Xem thêm: Viber

của một gen ngoại lai
– Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và
khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome
– Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có khả năng khác nhau.
Cần xem xét một số vấn đề như: chỉ có một số ít tế bào có khả năng biến nạp
và tái sinh cây. Ở các tế bào khác có hai trường hợp có thể xảy ra: một số tế
bào nếu được tạo điều kiện phù hợp thì trở nên có khả năng, một số khác
hoàn toàn không có khả năng biến nạp và tái sinh cây.
– Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu
gen, từng cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan.
– Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của ADN ngoại lai. Vì thế, cho
đến nay chỉ có thể chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông qua
Agrobacterium, virus và bắn gen hoặc phải phá bỏ thành tế bào để chuyển
gen bằng phương pháp xung điện, siêu âm và vi tiêm.
– Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ với sự
biểu hiện tạm thời của gen
– Các ADN (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủ
chưa đảm bảo là đã liên kết ổn định với genome
– Các ADN (trừ virus) không chuyển từ tế bào này sang tế bào kia, nó
chỉ ở nơi mà nó được đưa vào
Thủy Hồng
5
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
– Trong khi đó, ADN của virus khi xâm nhập vào genom cây chủ lại
không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ngoại
trừ mô phân sinh (meristem).
2. Các bước trong kỹ thuật chuyển gen
Từ khi người ta khám phá ra rằng các thí nghiệm chuyển gen có thể
thực hiện nhờ một loại vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, thì các nhà
khoa học tin rằng Agrobacterium có thể chuyển gen vào tất cả các cây trồng.

Nhưng sau đó kết quả thực tế cho thấy chuyển gen bằng Agrobacterium
không thể thực hiện được trên cây ngũ cốc (một lá mầm) vì thế mà hàng loạt
các kỹ thuật chuyển gen khác đã được phát triển đó là các kỹ thuật chuyển
gen trực tiếp như bắn gen bằng vi đạn (bombardement/ gene gun), vi tiêm
(microinjection), xung điện (electroporation), silicon carbide, điện di
(electrophoresis), siêu âm (ultrasonic), chuyển gen qua ống phấn (pollen
tube)… Đến nay, nhờ cải tiến các vector chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen
bằng A. tumefaciens đã thành công cả ở cây ngũ cốc đặc biệt là lúa. Kỹ thuật
này trở nên một kỹ thuật đầy triển vọng đối với cây chuyển gen ở thực vật.
Quá trình chuyển gen được thực hiện qua các bước sau:
– Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm
– Phân lập gen (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cADN hoặc từ thư viện
genomic ADN)
– Gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp
– Biến nạp vào E. coli
– Tách chiết ADN plasmid
– Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương
pháp khác nhau đã kể trên
– Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc
– Tái sinh cây biến nạp
Thủy Hồng
6
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
– Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc Southern blot)
và đánh giá mức độ biểu hiện của chúng (Northern blot, Western blot,
ELISA hoặc các thử nghiệm in vivo khác…)
Nguyên liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào thực vật riêng rẽ,
các mô hoặc cây hoàn chỉnh.
Cản trở lớn nhất của sự tiếp nhận ADN ở phần lớn sinh vật là thành tế
bào. Muốn làm mất thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzym và

dưới những điều kiện thích hợp người ta có thể tạo ra tế bào trần, tế bào trần
tiếp nhận ADN nói chung dễ dàng. Sau khi biến nạp người ta tách những
enzym phân giải và để cho tế bào phát triển, thành tế bào mới được tạo
thành. Các tế bào biến nạp này được nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo
thích hợp cùng với các chất kích thích sinh trưởng để tạo thành cây hoàn
chỉnh. Sau đó bằng các phương pháp phân tích genome như PCR, Southern
blot, Northern blot được thực hiện để tìm ra chính xác những cây biến đổi
gen.
3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật
Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu là chuyển gen trực tiếp và
chuyển gen gián tiếp.
3.1. Các phương pháp chuyển gen gián tiếp
3.1.1. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens
* Nguyên lý chung
Sử dụng vi sinh vật đất Agrobacterium (là vi khuẩn Gram âm) để
chuyển gen ở thực vật là phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay
nhờ vào khả năng gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật một cách chính xác
và ổn định.
Sự chuyển gen ở thực vật dùng A. tumefaciens dựa trên nguyên lý như
hình sau
Thủy Hồng
7
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
Hình1. Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật (tumour inducing
plasmid- Ti plasmid), plasmid này chứa các gen vir và vùng gen cần chuyển (T-DNA). Gen
quan tâm được chèn vào vùng T-DNA. Các tế bào tổn thương thực vật tiết ra hợp chất bảo
Thủy Hồng
8
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
vệ, hợp chất này kích thích sự biểu hiện gen vir ở Agrobacterium. Vir protein tạo ra T-

strand từ vùng T-DNA trên Ti-plasmid. Sau đó vi khuẩn gắn vào tế bào thực vật, T-strand
và một số protein vir chuyển vào tế bào thực vật qua kênh vận chuyển. Trong tế bào thực
vật, các protein vir tương tác với T-strand tạo ra phức hệ (T- complex). Phức hệ này vào
nhân tế bào thực vật, T-DNA chèn vào bộ gen thực vật và biểu hiện gen quan tâm.

Hình 2. Vi khuẩn A.tumefaciens
Cụ thể như sau:
Phương pháp này sử dụng Ti plasmid của A.tumefaciens hoặc Ti
plasmid của Arhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào. Ti plamid gồm hai
thành phần: T- DNA và vùng Vir.
T- DNA có thể chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, chính
nhờ vậy mà có thể gắn gen muốn chuyển vào T- DNA để đưa vào tế bào. T-
DNA chứa gen điều hoà sinh trưởng cục bộ (auxin, cytokinie), gen tổng hợp
các chất Opine và gen gây khối u. Đoạn cuối có 25 cặp bazơ lặp lại, bất kì
đoạn nào trong vùng này cũng có thể xâm nhập vào phân tử ADN thực vật.
Trong plasmid vị trí của T- DNA được giới hạn bởi bờ trái và bờ phải.
Vùng Vir phụ trách khả năng lây nhiễm. Chúng gồm 6 nhóm từ VirA
đến VirG và VirE có tác dụng làm tăng tần số biến nạp.
Thủy Hồng
9
Bộ gen của
vi khuẩn
Ti plasmid
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
Để thiết kế vector dùng trong biến nạp: trước hết là cắt bộ gen điều
hòa sinh trưởng cục bộ, sau đó gắn thêm gen chỉ thị (kháng thuốc hoặc chất
diệt cỏ) cùng với đoạn điều khiển phù hợp để chọn các thể biến nạp và cuối
cùng gắn gen cần biến nạp.
* Các plasmid của Agrobacterium được sử dụng trong công nghệ gen
thực vật gồm có 2 loại: vector liên hợp và vector nhị thể.

– Vector liên hợp (Cointegrated vector)
Vector liên hợp dựa trên sự tái tổ hợp của 2 plasmid. Một vector liên
hợp gồm có: vị trí để ghép các gen quan tâm, thường vị trí này có nguồn gốc
từ plasmid của vi khuẩn E.coli. Gen chỉ thị kháng sinh giúp cho chọn lọc
trong vi khuẩn E.coli, Agrobacterium và gen chọn lọc hoạt động được ở tế
bào thực vật. Như vậy vector liên hợp được hình thành từ một plasmid mang
trình tự ADN mong muốn và plasmid kia có chứa vùng vir gen và vùng bờ
lặp lại của T-ADN. Sau tái tổ hợp, một vector liên hợp được tạo ra và dùng
cho chuyển gen vào thực vật.
– Vector nhị thể (Binary vector)
Vector nhị thể là hệ thống dùng 2 plasmid riêng biệt: một cung cấp T-
ADN đã mất độc tính gây khối u, plasmid kia là Ti plasmid có khả năng
thâm nhập vào tế bào thực vật (mang các gen vir). Plasmid thứ nhất mang
gen chọn lọc ở thực vật và gen sẽ được ghép vào bộ gen thực vật. Khi
plasmid này được đưa vào chủng Agrobacterium có chứa Ti plasmid, những
sản phẩm mang gen vir có thể đưa T-AND vào tế bào thực vật, mặc dù T-
ADN nằm trên phân tử ADN khác.
* Sử dụng Agrobacterium để chuyển gen đã thu được nhiều kết quả,
đặc biệt là chuyển gen vào lúa mì và các cây lương thực quan trọng. Nhiều
giống lúa chuyển gen có giá trị đặc biệt như giống lúa Golden rice có chứa
hàm lượng vitamin A cao gấp nhiều lần so với lúa thông thường. Nhờ giống
Thủy Hồng
10
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
lúa này đã giải quyết được vấn đề hết sức khó khăn về sự thiếu vitamin A ở
các nước đang phát triển, đặc biệt là ở Châu Phi.
* Ưu điểm
– Gen ít bị đào thải
– Số lượng bản sao ít hơn. Do đó tránh được hiện tượng ức chế lẫn
nhau và câm lặng lẫn nhau.

– Tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật do sự phụ thuộc chặt chẽ vào
hệ thống protein Vir, còn ở những phương pháp khác gen mục tiêu được tái
tổ hợp chuyên biệt nhờ hai trình tự IS hai đầu nhưng dễ dàng bị tách ra ngay
sau đó.
* Nhược điểm
– Có phổ tấn công giới hạn
– Gây khối u cho cả cây khỏa tự và cây hai lá mầm nhưng lại không
gây khối u cho cây một lá mầm (do cây một lá mầm là cây thuộc nhóm tiến
hoá nhất, nó tích lũy nhiều cơ chế kháng bệnh hơn cây hai lá mầm như khi
bị thương các tế bào có xu hướng hóa gỗ chứ không phân chia mạnh để tái
tạo hoặc tiếp hợp chất phenol như cây hai lá mầm…)
3.1.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus
Ngoài việc sử dụng vi khuẩn, người ta còn sử dụng virus làm vector
chuyển gen vào cây trồng. Chuyển gen nhờ virus có thể thuận lợi do virus dễ
xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật và động vật đồng thời virus có thể
mang đoạn ADN lớn hơn nhiều so với khả năng của plasmid. Tuy nhiên,
virus làm vector chuyển gen cần phải có các tiêu chuẩn sau:
– Hệ gen của virus phải là ADN
– Virus có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các
lỗ ở vách tế bào
Thủy Hồng
11
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
– Có khả năng mang được đoạn ADN (gen) mới, sau đó chuyển gen
này vào tế bào thực vật
– Có phổ ký chủ rộng (trên nhiều loài cây)
– Không gây tác hại đáng kể cho thực vật
Đối chiếu các tiêu chuẩn trên, hiện nay có hai loại virus được sử dụng
làm vector chuyển gen là caulimovirus và geminivirus. Tuy nhiên, việc sử
dụng virus để chuyển gen ở thực vật còn ít được sử dụng vì ADN virus khó

ghép nối với hệ gen của thực vật.
3.2. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp
3.2.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun)

Hình 3. Súng bắn gen
* Nguyên lý
Ngâm những viên đạn nhỏ (vi đạn) bằng vàng hoặc tungsten có kích
thước cực nhỏ, đường kính khoảng 0,5 – 1,5 µm với dung dịch có chứa đoạn
ADN ngoại lai cần chuyển vào tế bào thực vật. Các vi đạn này được làm khô
trên một đĩa kim loại mỏng có kích thước 0,5 – 0,9 cm. Đĩa kim loại này
được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) bằng nhựa, hoặc vật
liệu nhẹ. Viên đạn lớn có kích thước vừa khít đầu nòng súng bắn gen. Khi
Thủy Hồng
12
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
bắn, áp suất hơi sẽ đẩy viên đạn đi với tốc độ cao. Tới đầu nòng súng, viên
đạn lớn sẽ bị cản lại bởi một lưới thép mịn, còn các viên đạn nhỏ (vi đạn)
vẫn tiếp tục di chuyển với tốc độ lớn tới 1300 m/giây đến đối tượng bắn rồi
rồi xuyên vào tế bào. Sau khi bắn, tách các mô, tế bào và nuôi cấy invitro để
tái sinh cây. Các gen cần chuyển có thể tái tổ hợp vào hệ gen của cây, từ đó
tạo thành cây chuyển gen. Chỉ có một tỷ lệ nào đó của tế bào mang gen
chuyển do vậy cần phải chọn lọc. Người ta thường dùng khí nén là helium
áp lực cao để bắn gen.

Hình 4. Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng bắn gen
* Ưu điểm
Thủy Hồng
13
Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng
– Thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào

– Nguyên liệu để bắn đa dạng (hạt phấn, tế bào nuôi cấy, tế bào mô
hóa và mô phân sinh)
* Nhược điểm
Tần số biến nạp ổn định thấp vì thế theo Potrykus thì ưu việt của
phương pháp này là nghiên cứu các gen tạm thời. Tuy nhiên, những năm gần
đây phương pháp này đã thành công trên lúa, mía, đu đủ, bông đã khẳng
định tính ưu việt của phương pháp này.
3.2.2. Chuyển gen bằng xung điện (electroporation)
* Nguyên lý
Trong công nghệ di truyền thực vật, người ta sử dụng phương pháp
xung điện để chuyển gen vào protoplast thực vật. Ở điện thế cao, trong thời
gian ngắn có thể tạo ra các lỗ trên màng tế bào trần (protoplast) làm cho
ADN bên ngoài môi trường có thể xâm nhập vào bên trong tế bào. Người ta
chuẩn bị protoplast với các plasmid tái tổ hợp đã mang gen mong muốn cần
chuyển vào thực vật.
Dùng thiết bị xung điện tạo điện thế cao (200 – 400 V/cm) trong
khoảng thời gian 4 – 5 phần nghìn giây. Kết quả làm màng tế bào trần xuất
hiện các lỗ thủng tạm thời giúp cho plasmid có thể xâm nhập và gắn vào hệ
gen của thực vật. Quá trình được thực hiện trong cuvett chuyên dụng. Sau
quá trình xung điện, đem protoplast nuôi trong môi trường nuôi cấy thích
hợp, môi trường chọn lọc để tách các protoplast đã được biến nạp. Tiếp theo
là nuôi cấy invitro, tái sinh cây và chọn lọc cây chuyển gen.
* Đối với protoplast phương pháp xung điện đã có kết quả khích lệ
nhưng chưa chứng minh chắc chắn cho sự biến nạp. Hơn nữa, việc nuôi cấy
protoplast ở một số loài cây vẫn còn gặp khó khăn.
3.2.3. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection)
Thủy Hồng
14
( RNAi ) ………………………………………………………………………………………………. C. KẾT LUẬN ………………………………………………………………………………………. TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………………………………………………….. Thủy HồngKỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụngA. MỞ ĐẦUMột trong những kỹ thuật của công nghệ tiên tiến tế bào thực vật là kỹ thuậtchuyển gen. Trước đây, để tạo một giống mới những nhà tạo giống thường sửdụng chiêu thức truyền thống cuội nguồn để tổng hợp lại những gen giữa hai thành viên thựcvật tạo ra khung hình lai mang những tính trạng mong ước. Phương pháp nàyđược triển khai bằng cách chuyển hạt phấn từ cây này sang nhụy hoa của câykhác. Tuy nhiên phép lai chéo này bị hạn chế bởi nó chỉ hoàn toàn có thể thực hiệnđược giữa những thành viên cùng loài ( lai gần ), lai giữa những thành viên khác loài ( laixa ) thường bị bất thụ do đó không hề tạo ra con lai được. Tuy nhiên, lai gầncũng phải mất nhiều thời hạn mới thu được những hiệu quả mong ước vàthông thường những tính trạng chăm sóc lại không sống sót trong những loàicó họ hàng gần nhau. Kể từ năm 1984, là lúc người ta khởi đầu tạo được cây cối chuyểngen và đến nay đã có những bước tiến lớn. Nhiều cây cối quan trọngchuyển gen sinh ra như lúa, ngô, lúa mì, đậu tương, bông, khoai tây, cà chua, cải dầu, đậu Hà Lan, bắp cải … Các gen được chuyển là gen kháng vi sinhvật, virus gây bệnh, kháng côn trùng nhỏ phá hại, gen có năng lực sản xuấtnhững loại protein mới, gen chịu hạn, gen kháng thuốc diệt cỏ … Kỹ thuậtchuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một loài cây trồngnhững gen mong ước có nguồn gốc từ những khung hình sống khác nhau, không riêng gì giữa những loài có họ gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau. Phương pháp hữu hiệu này được cho phép những nhà tạo giống thực vật thu đượcgiống mới nhanh hơn và vượt qua những số lượng giới hạn của kỹ thuật tạo giốngtruyền thống. Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen là kỹ thuật đưa một gen lạ ( một đoạnADN, ARN ) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ sống sót ở những plasmid trong tếThủy HồngKỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụngbào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, sống sót và tái bản cùng với bộ gen của tếbào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động giải trí tổng hợp những protein đặc hiệu, gây đổi khác những đặc thù đã có hoặc làm Open những đặc thù mới củanhững khung hình chuyển gen. Nhìn chung, việc ứng dụng cây chuyển gen đã có những quyền lợi rõ rệtnhư sau : – Tăng sản lượng – Giảm chi phí sản xuất – Tăng doanh thu nông nghiệp – Cải thiện môi trườngNhững cây chuyển gen “ thế hệ thứ nhất ” đã giúp giảm ngân sách sảnxuất. Ngày nay, những nhà khoa học đang hướng đến việc tạo ra những câychuyển gen “ thế hệ thứ hai ” nhằm mục đích tăng những giá trị dinh dưỡng hoặc có nhữngđặc điểm thích hợp cho công nghiệp chế biến. Lợi ích của những cây trồngnày hướng trực tiếp hơn vào người tiêu dùng. Chẳng hạn như : – Lúa gạo giàu vitamin A và sắt – Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột – Vacxin thực phẩm ( edible vaccine ) ở ngô và khoai tây – Những giống ngô hoàn toàn có thể trồng được trong điều kiện kèm theo nghèo dinhdưỡng – Dầu ăn có lợi cho sức khỏe thể chất hơn từ đậu nành và cải dầuTuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm cũng có những rủi ro tiềm ẩn tiềm ẩntrong việc tăng trưởng những kỹ thuật mới. Bao gồm : – Mối nguy khốn trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặclàm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm – Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây xanh sang họhoang dạiThủy HồngKỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng – Sâu bệnh có rủi ro tiềm ẩn tăng cường tính kháng với những chất độc tiết ratừ cây chuyển gen – Nguy cơ những chất độc này tác động ảnh hưởng tới những sinh vật không phải làloại sinh vật cần diệt, cho nên vì thế hoàn toàn có thể làm mất cân đối sinh tháiNhìn chung, mặc dầu còn những điểm còn chưa rõ ràng về cây chuyểngen nhưng với năng lực tạo ra những giống cây cối mới có giá trị kinh tế tài chính, công nghệ tiên tiến này có vai trò không hề phủ nhận được. Tuy vậy, vẫn còn một sốvấn đề đáng lo lắng. Để xử lý những yếu tố này thì những Kết luận thuđược phải dựa trên những thông tin an toàn và đáng tin cậy và có cơ sở khoa học. Triển vọng của công nghệ tiên tiến chuyển gen thực vật là rất lớn, được cho phép tạora những giống cây cối mang đặc tính di truyền trọn vẹn mới, có lợi cho conngười mà trong chọn giống thường thì phải trông chờ vào đột biến tựnhiên, không hề luôn luôn có được. Đối với sự tăng trưởng của công nghệsinh học trong thế kỷ XXI thì công nghệ tiên tiến chuyển gen sẽ có một vị trí đặc biệtquan trọng. Có thể nói công nghệ tiên tiến chuyển gen là một hướng công nghệ tiên tiến caocủa công nghệ sinh học văn minh ship hàng sản xuất và đời sống. Thủy HồngKỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụngB. NỘI DUNG1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển genKhi đặt ra mục tiêu và triển khai thí nghiệm chuyển gen cần chú ýmột số yếu tố sinh học ảnh hưởng tác động đến quy trình chuyển gen như sau : – Không phải hàng loạt tế bào đều biểu lộ tính toàn năng ( totipotency ) – Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhậpcủa một gen ngoại lai – Cây biến nạp chỉ hoàn toàn có thể tái sinh từ những tế bào có năng lực tái sinh vàkhả năng thu nhận gen biến nạp vào genome – Mô thực vật là hỗn hợp những quần thể tế bào có năng lực khác nhau. Cần xem xét 1 số ít yếu tố như : chỉ có 1 số ít ít tế bào có năng lực biến nạpvà tái sinh cây. Ở những tế bào khác có hai trường hợp hoàn toàn có thể xảy ra : 1 số ít tếbào nếu được tạo điều kiện kèm theo tương thích thì trở nên có năng lực, 1 số ít kháchoàn toàn không có năng lực biến nạp và tái sinh cây. – Thành phần của những quần thể tế bào được xác lập bởi loài, kiểugen, từng cơ quan, từng tiến trình tăng trưởng của mô và cơ quan. – Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của ADN ngoại lai. Vì thế, chođến nay chỉ hoàn toàn có thể chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông quaAgrobacterium, virus và bắn gen hoặc phải phá bỏ thành tế bào để chuyểngen bằng giải pháp xung điện, siêu âm và vi tiêm. – Khả năng xâm nhập không thay đổi của gen vào genome không tỷ suất với sựbiểu hiện trong thời điểm tạm thời của gen – Các ADN ( trừ virus ) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủchưa bảo vệ là đã link không thay đổi với genome – Các ADN ( trừ virus ) không chuyển từ tế bào này sang tế bào kia, nóchỉ ở nơi mà nó được đưa vàoThủy HồngKỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng – Trong khi đó, ADN của virus khi xâm nhập vào genom cây chủ lạikhông link với genome mà chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ngoạitrừ mô phân sinh ( meristem ). 2. Các bước trong kỹ thuật chuyển genTừ khi người ta tò mò ra rằng những thí nghiệm chuyển gen có thểthực hiện nhờ một loại vi trùng đất Agrobacterium tumefaciens, thì những nhàkhoa học tin rằng Agrobacterium hoàn toàn có thể chuyển gen vào tổng thể những cây cối. Nhưng sau đó tác dụng thực tiễn cho thấy chuyển gen bằng Agrobacteriumkhông thể triển khai được trên cây ngũ cốc ( một lá mầm ) cho nên vì thế mà hàng loạtcác kỹ thuật chuyển gen khác đã được tăng trưởng đó là những kỹ thuật chuyểngen trực tiếp như bắn gen bằng vi đạn ( bombardement / gene gun ), vi tiêm ( microinjection ), xung điện ( electroporation ), silicon carbide, điện di ( electrophoresis ), siêu âm ( ultrasonic ), chuyển gen qua ống phấn ( pollentube ) … Đến nay, nhờ nâng cấp cải tiến những vector chuyển gen nên kỹ thuật chuyển genbằng A. tumefaciens đã thành công xuất sắc cả ở cây ngũ cốc đặc biệt quan trọng là lúa. Kỹ thuậtnày trở nên một kỹ thuật đầy triển vọng so với cây chuyển gen ở thực vật. Quá trình chuyển gen được triển khai qua những bước sau : – Xác định gen tương quan đến tính trạng cần chăm sóc – Phân lập gen ( PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cADN hoặc từ thư việngenomic ADN ) – Gắn gen vào vector biểu lộ ( expression vector ) để biến nạp – Biến nạp vào E. coli – Tách chiết ADN plasmid – Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong những phươngpháp khác nhau đã kể trên – Chọn lọc những thể biến nạp trên môi trường tự nhiên tinh lọc – Tái sinh cây biến nạpThủy HồngKỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng – Phân tích để xác nhận thành viên chuyển gen ( PCR hoặc Southern blot ) và nhìn nhận mức độ biểu lộ của chúng ( Northern blot, Western blot, ELISA hoặc những thử nghiệm in vivo khác … ) Nguyên liệu để triển khai sự biến nạp là những tế bào thực vật riêng rẽ, những mô hoặc cây hoàn hảo. Cản trở lớn nhất của sự đảm nhiệm ADN ở phần nhiều sinh vật là thành tếbào. Muốn làm mất thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzym vàdưới những điều kiện kèm theo thích hợp người ta hoàn toàn có thể tạo ra tế bào trần, tế bào trầntiếp nhận ADN nói chung thuận tiện. Sau khi biến nạp người ta tách nhữngenzym phân giải và để cho tế bào tăng trưởng, thành tế bào mới được tạothành. Các tế bào biến nạp này được nuôi cấy trên những môi trường tự nhiên nhân tạothích hợp cùng với những chất kích thích sinh trưởng để tạo thành cây hoànchỉnh. Sau đó bằng những giải pháp nghiên cứu và phân tích genome như PCR, Southernblot, Northern blot được triển khai để tìm ra đúng chuẩn những cây biến đổigen. 3. Một số giải pháp chuyển gen ở thực vậtCó hai hình thức chuyển gen hầu hết là chuyển gen trực tiếp vàchuyển gen gián tiếp. 3.1. Các chiêu thức chuyển gen gián tiếp3. 1.1. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens * Nguyên lý chungSử dụng vi sinh vật đất Agrobacterium ( là vi trùng Gram âm ) đểchuyển gen ở thực vật là giải pháp hiệu suất cao và thông dụng nhất hiện naynhờ vào năng lực gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật một cách chính xácvà không thay đổi. Sự chuyển gen ở thực vật dùng A. tumefaciens dựa trên nguyên tắc nhưhình sauThủy HồngKỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụngHình1. Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật ( tumour inducingplasmid – Ti plasmid ), plasmid này chứa những gen vir và vùng gen cần chuyển ( T-DNA ). Genquan tâm được chèn vào vùng T-DNA. Các tế bào tổn thương thực vật tiết ra hợp chất bảoThủy HồngKỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụngvệ, hợp chất này kích thích sự biểu lộ gen vir ở Agrobacterium. Vir protein tạo ra T-strand từ vùng T-DNA trên Ti-plasmid. Sau đó vi trùng gắn vào tế bào thực vật, T-strandvà một số ít protein vir chuyển vào tế bào thực vật qua kênh luân chuyển. Trong tế bào thựcvật, những protein vir tương tác với T-strand tạo ra phức hệ ( T – complex ). Phức hệ này vàonhân tế bào thực vật, T-DNA chèn vào bộ gen thực vật và bộc lộ gen chăm sóc. Hình 2. Vi khuẩn A.tumefaciensCụ thể như sau : Phương pháp này sử dụng Ti plasmid của A.tumefaciens hoặc Tiplasmid của Arhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào. Ti plamid gồm haithành phần : T – DNA và vùng Vir. T – DNA hoàn toàn có thể chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, chínhnhờ vậy mà hoàn toàn có thể gắn gen muốn chuyển vào T – DNA để đưa vào tế bào. T-DNA chứa gen điều hoà sinh trưởng cục bộ ( auxin, cytokinie ), gen tổng hợpcác chất Opine và gen gây khối u. Đoạn cuối có 25 cặp bazơ tái diễn, bất kìđoạn nào trong vùng này cũng hoàn toàn có thể xâm nhập vào phân tử ADN thực vật. Trong plasmid vị trí của T – DNA được số lượng giới hạn bởi bờ trái và bờ phải. Vùng Vir đảm nhiệm năng lực lây nhiễm. Chúng gồm 6 nhóm từ VirAđến VirG và VirE có công dụng làm tăng tần số biến nạp. Thủy HồngBộ gen củavi khuẩnTi plasmidKỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụngĐể phong cách thiết kế vector dùng trong biến nạp : trước hết là cắt bộ gen điềuhòa sinh trưởng cục bộ, sau đó gắn thêm gen thông tư ( kháng thuốc hoặc chấtdiệt cỏ ) cùng với đoạn điều khiển và tinh chỉnh tương thích để chọn những thể biến nạp và cuốicùng gắn gen cần biến nạp. * Các plasmid của Agrobacterium được sử dụng trong công nghệ tiên tiến genthực vật gồm có 2 loại : vector phối hợp và vector nhị thể. – Vector phối hợp ( Cointegrated vector ) Vector phối hợp dựa trên sự tái tổng hợp của 2 plasmid. Một vector liênhợp gồm có : vị trí để ghép những gen chăm sóc, thường vị trí này có nguồn gốctừ plasmid của vi trùng E.coli. Gen thông tư kháng sinh giúp cho chọn lọctrong vi trùng E.coli, Agrobacterium và gen tinh lọc hoạt động giải trí được ở tếbào thực vật. Như vậy vector phối hợp được hình thành từ một plasmid mangtrình tự ADN mong ước và plasmid kia có chứa vùng vir gen và vùng bờlặp lại của T-ADN. Sau tái tổng hợp, một vector phối hợp được tạo ra và dùngcho chuyển gen vào thực vật. – Vector nhị thể ( Binary vector ) Vector nhị thể là mạng lưới hệ thống dùng 2 plasmid riêng không liên quan gì đến nhau : một cung ứng T-ADN đã mất độc tính gây khối u, plasmid kia là Ti plasmid có khả năngthâm nhập vào tế bào thực vật ( mang những gen vir ). Plasmid thứ nhất manggen tinh lọc ở thực vật và gen sẽ được ghép vào bộ gen thực vật. Khiplasmid này được đưa vào chủng Agrobacterium có chứa Ti plasmid, nhữngsản phẩm mang gen vir hoàn toàn có thể đưa T-AND vào tế bào thực vật, mặc dầu T-ADN nằm trên phân tử ADN khác. * Sử dụng Agrobacterium để chuyển gen đã thu được nhiều tác dụng, đặc biệt quan trọng là chuyển gen vào lúa mì và những cây lương thực quan trọng. Nhiềugiống lúa chuyển gen có giá trị đặc biệt quan trọng như giống lúa Golden rice có chứahàm lượng vitamin A cao gấp nhiều lần so với lúa thường thì. Nhờ giốngThủy Hồng10Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụnglúa này đã xử lý được yếu tố rất là khó khăn vất vả về sự thiếu vitamin A ởcác nước đang tăng trưởng, đặc biệt quan trọng là ở Châu Phi. * Ưu điểm – Gen ít bị đào thải – Số lượng bản sao ít hơn. Do đó tránh được hiện tượng kỳ lạ ức chế lẫnnhau và câm lặng lẫn nhau. – Tồn tại vững chắc trong khung hình thực vật do sự phụ thuộc vào ngặt nghèo vàohệ thống protein Vir, còn ở những chiêu thức khác gen tiềm năng được táitổ hợp chuyên biệt nhờ hai trình tự IS hai đầu nhưng thuận tiện bị tách ra ngaysau đó. * Nhược điểm – Có phổ tiến công số lượng giới hạn – Gây khối u cho cả cây khỏa tự và cây hai lá mầm nhưng lại khônggây khối u cho cây một lá mầm ( do cây một lá mầm là cây thuộc nhóm tiếnhoá nhất, nó tích góp nhiều chính sách kháng bệnh hơn cây hai lá mầm như khibị thương những tế bào có xu thế hóa gỗ chứ không phân loại mạnh để táitạo hoặc tiếp hợp chất phenol như cây hai lá mầm … ) 3.1.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ virusNgoài việc sử dụng vi trùng, người ta còn sử dụng virus làm vectorchuyển gen vào cây cối. Chuyển gen nhờ virus hoàn toàn có thể thuận tiện do virus dễxâm nhập và lây lan trong khung hình thực vật và động vật hoang dã đồng thời virus có thểmang đoạn ADN lớn hơn nhiều so với năng lực của plasmid. Tuy nhiên, virus làm vector chuyển gen cần phải có những tiêu chuẩn sau : – Hệ gen của virus phải là ADN – Virus có năng lực vận động và di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua cáclỗ ở vách tế bàoThủy Hồng11Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng – Có năng lực mang được đoạn ADN ( gen ) mới, sau đó chuyển gennày vào tế bào thực vật – Có phổ ký chủ rộng ( trên nhiều loài cây ) – Không gây mối đe dọa đáng kể cho thực vậtĐối chiếu những tiêu chuẩn trên, lúc bấy giờ có hai loại virus được sử dụnglàm vector chuyển gen là caulimovirus và geminivirus. Tuy nhiên, việc sửdụng virus để chuyển gen ở thực vật còn ít được sử dụng vì ADN virus khóghép nối với hệ gen của thực vật. 3.2. Các chiêu thức chuyển gen trực tiếp3. 2.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen ( gene gun ) Hình 3. Súng bắn gen * Nguyên lýNgâm những viên đạn nhỏ ( vi đạn ) bằng vàng hoặc tungsten có kíchthước cực nhỏ, đường kính khoảng chừng 0,5 – 1,5 µm với dung dịch có chứa đoạnADN ngoại lai cần chuyển vào tế bào thực vật. Các vi đạn này được làm khôtrên một đĩa sắt kẽm kim loại mỏng dính có kích cỡ 0,5 – 0,9 cm. Đĩa sắt kẽm kim loại nàyđược gắn vào đầu một viên đạn lớn ( macroprojectile ) bằng nhựa, hoặc vậtliệu nhẹ. Viên đạn lớn có kích cỡ vừa khít đầu nòng súng bắn gen. KhiThủy Hồng12Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụngbắn, áp suất hơi sẽ đẩy viên đạn đi với vận tốc cao. Tới đầu nòng súng, viênđạn lớn sẽ bị cản lại bởi một lưới thép mịn, còn những viên đạn nhỏ ( vi đạn ) vẫn liên tục chuyển dời với vận tốc lớn tới 1300 m / giây đến đối tượng người dùng bắn rồirồi xuyên vào tế bào. Sau khi bắn, tách những mô, tế bào và nuôi cấy invitro đểtái sinh cây. Các gen cần chuyển hoàn toàn có thể tái tổng hợp vào hệ gen của cây, từ đótạo thành cây chuyển gen. Chỉ có một tỷ suất nào đó của tế bào mang genchuyển do vậy cần phải tinh lọc. Người ta thường dùng khí nén là heliumáp lực cao để bắn gen. Hình 4. Sơ đồ nguyên tắc hoạt động giải trí của súng bắn gen * Ưu điểmThủy Hồng13Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng – Thao tác thuận tiện, bắn một lần được nhiều tế bào – Nguyên liệu để bắn phong phú ( hạt phấn, tế bào nuôi cấy, tế bào môhóa và mô phân sinh ) * Nhược điểmTần số biến nạp không thay đổi thấp cho nên vì thế theo Potrykus thì ưu việt củaphương pháp này là nghiên cứu và điều tra những gen trong thời điểm tạm thời. Tuy nhiên, những năm gầnđây giải pháp này đã thành công xuất sắc trên lúa, mía, đu đủ, bông đã khẳngđịnh tính ưu việt của chiêu thức này. 3.2.2. Chuyển gen bằng xung điện ( electroporation ) * Nguyên lýTrong công nghệ tiên tiến di truyền thực vật, người ta sử dụng phương phápxung điện để chuyển gen vào protoplast thực vật. Ở điện thế cao, trong thờigian ngắn hoàn toàn có thể tạo ra những lỗ trên màng tế bào trần ( protoplast ) làm choADN bên ngoài thiên nhiên và môi trường hoàn toàn có thể xâm nhập vào bên trong tế bào. Người tachuẩn bị protoplast với những plasmid tái tổng hợp đã mang gen mong ước cầnchuyển vào thực vật. Dùng thiết bị xung điện tạo điện thế cao ( 200 – 400 V / cm ) trongkhoảng thời hạn 4 – 5 phần nghìn giây. Kết quả làm màng tế bào trần xuấthiện những lỗ thủng trong thời điểm tạm thời giúp cho plasmid hoàn toàn có thể xâm nhập và gắn vào hệgen của thực vật. Quá trình được thực thi trong cuvett chuyên được dùng. Sauquá trình xung điện, đem protoplast nuôi trong thiên nhiên và môi trường nuôi cấy thíchhợp, môi trường tự nhiên tinh lọc để tách những protoplast đã được biến nạp. Tiếp theolà nuôi cấy invitro, tái sinh cây và tinh lọc cây chuyển gen. * Đối với protoplast giải pháp xung điện đã có tác dụng khích lệnhưng chưa chứng tỏ chắc như đinh cho sự biến nạp. Hơn nữa, việc nuôi cấyprotoplast ở một số ít loài cây vẫn còn gặp khó khăn vất vả. 3.2.3. Chuyển gen bằng vi tiêm ( microinjection ) Thủy Hồng14

5/5 - (1 vote)
Subscribe
Notify of
guest
0 Comments
Inline Feedbacks
View all comments