Ngày đăng: 26/06/2015, 08:29
ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TIỂU LUẬN Đề tài: “ỨNG DỤNG CỦA SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH” Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc Học viên thực hiện : Nguyễn Thị Thanh Vinh Lớp : LL&PPDH bộ môn Sinh học K22 Huế, 1/1/2014 GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo – PGS.TS Nguyễn Bá Lộc đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu. Tuy đã có nhiều cố gắng, nhưng chắc chắn tiểu luận của tôi còn có rất nhiều thiếu sót. Rất mong nhận được sự góp ý của thầy giáo và các bạn trong lớp. Xin chân thành cám ơn! MỤC LỤC – 2 – GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh 1 Phần I: ĐẶT VẤN ĐỀ 4 Phần II: NỘI DUNG 5 II.1. Sinh học phân tử 5 II.1.1. Khái niệm 5 II.2. Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh 14 Phần III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 III.1. Kết luận 36 III.2. Đề nghị 36 Phần IV: TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 – 3 – GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh Phần I: ĐẶT VẤN ĐỀ Sang thế kỉ XXI, khoa học – công nghệ có những bước phát triển nhảy vọt. Nhiều công trình nghiên cứu, nhiều thành tựu mới ra đời đã đáp ứng và đảm bảo nhu cầu cuộc sống cho con người ngày một tốt hơn. Y học trong thế kỷ XXI cũng có những bước tiến dài, đạt được những kết quả khả quan: Nhiều căn bệnh hiểm nghèo đã được chặn đứng, nhiều căn bệnh khác đang có triển vọng sẽ tìm ra cách điều trị, … Tất cả những điều đó đạt được là nhờ sự ứng dụng của ngành Sinh học phân tử vào trong y học Sinh học phân tử là môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật hay các hiện tượng sinh học ở mức độ phân tử. Cũng như nhiều ngành khoa học khác, Sinh học phân tử trong thời gian qua cũng phát triển mạnh mẽ và những thành tựu của nó đã được ứng dụng có hiệu quả trong các lĩnh vực khác nhau của y học, mang lại cơ hội cho nhiều bệnh nhân, mở ra triển vọng về một nền y học phát triển trong tương lai. Nhận thấy được tầm quan trọng và lợi ích to lớn mà Sinh học phân tử mang lại cho y học liên quan trực tiếp đến sức khỏe và đời sống của chúng ta và nó là vấn đề mang tính thời sự nên em chọn đề tài “Ứng dụng của Sinh học phân tử chẩn đoán bệnh” với mong muốn mở mang kiến thức về môn học Sinh học phân tử và cập nhật những thành tựu mới của nó trong y học. – 4 – GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh Phần II: NỘI DUNG II.1. Sinh học phân tử II.1.1. Khái niệm Sinh học phân tử (molecular biology) là môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật hay các hiện tượng sinh vật ở mức độ phân tử. Mục đích của sinh học phân tử là tìm hiểu mối tương tác giữa các hệ thống khác nhau trong tế bào bao gồm cả mối liên hệ và tương tác giữa các phân tử DNA, RNA, quá trình tổng hợp protein cũng như tìm hiểu cơ chế điều hòa những mối tương tác này. Kiến thức về các mối tương tác trong từng đối tượng tế bào, mô, cơ quan, hệ cơ quan, cơ thể v.v. giúp ta tìm hiểu sâu hơn về học thuyết trung tâm (central Dogma) trong di truyền học từ đó có những can thiệp thích hợp để đưa đến những ứng dụng trong y dược học, nông nghiệp, công nghiệp, bảo vệ môi sinh.v.v. Sinh học phân tử cũng không chỉ giúp con người nghiên cứu hình thái của sinh vật ở mức độ tinh vi hơn mà còn nghiên cứu quá trình hình thành, phát triển (về số lượng và kích thước) của một tế bào, một cơ quan, một cá thể hay một loài cũng như nghiên cứu về chức năng của các quá trình đó. II.1.2. Các phương pháp nghiên cứu Sinh học phân tử II.1.2.1. Phương pháp PCR (Polymerase chain Reaction) II.1.2.1.1. Nguyên tắc: Tất cả các ADN – polymerase khi tiến hành tổng hợp một đoạn ADN mới đều cần có mạch khuôn ADN và 1 đoạn mồi. Mồi là đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với 1 đầu của mạch khuôn. ADN – polymerase làm nhiệm vụ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR dựa vào đặc tính hoạt động đó của ADN – polymerase. Khi cung cấp 2 mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với 2 đầu của ADN ta sẽ tổng hợp được đoạn ADN nằm giữa 2 mồi đó. * PCR thực hiện qua ba bước: – 5 – GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh – Bước 1: Biến tính phân tử ADN là khuôn: Để gây biến tính ADN, chuyển ADN mạch kép thành ADN mạch đơn, cần sử dụng nhiệt độ cao hơn nhiệt độ Tm phân tử, thường khoảng 92 – 95 0 C trong thời gian khoảng 1 phút. – Bước 2: Mồi bắt cặp với khuôn: Quá trình này xảy ra ở nhiệt độ tháp hơn Tm (40 – 70 0 C) trong khoảng 1 phút. – Bước 3: Nhờ ADN – poymerase, quá trình tổng hợp 2 chuỗi ADN xảy ra. Qua strinhf này được thực hiện ở nhiệt độ cao, khoảng 72 0 C, nhờ sử dụng ADN – polymerase chịu nhiệt: Tap-polymerase. Ba giai đoạn trên xảy ra theo chu kì và được lặp lại nhiều lần làm cho sau mỗi lần, số lượng mẫu tăng lên gấp đôi, là quá trình khuếch đại mẫu theo cấp số nhân, cứ sau khoảng 30 chu kỳ sẽ tạo ra được 10 6 bản sao của mẫu ban đầu. II.1.2.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR: – ADN mẫu : Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra với ADN thật tinh sạch. – Enzim: Enzim được sử dụng là enzim polymerase chịu nhiệt được tách ra từ vi khuẩn suối nước nóng. – Mồi – primer: Tức là những đoạn DNA đơn có kích thước chỉ vài chục base, có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc của chuỗi DNA đích khi chuỗi đích này được biến tính thành sợi đan. + Đoạn mồi có hai vai trò chính : (1) Quyết định nên tính đặc hiệu của thử nghiệm. – 6 – GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh (2) Khởi động men polymerase vì men polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3′, đang ở tình trạng sợi đôi. – Nhiệt độ (Tm): + Công thức được sử dụng trong điều kiện primer có khoảng 20 oligo nucleotit Td = 4(G+C)+2(A+T). A, T, G, C là số lượng các nucleotit trong oligo nucleotit. – Dung dịch đệm: Thường chứa muối đệm Tris HCL 10 mM, KCL 50Mm và MgCl2 2 1.5mM. Ngoài ra dung dịch đệm PCR còn có thể chứa 0.001% BSA hay Gelatine và trong một số phản ứng PCR còn có thể thêm tween hay formamide nữa. Ảnh hưởng lên thử nghiệm PCR nhiều nhất là nồng độ MgCl2, vì vậy để có được một thử nghiệm PCR có độ nhạy cao, phả ứng rõ nét, người ta phải tối ưu hóa phản ứng bằng cách thăm dò một nồng độ MgCl2 thích hợp nhất. – Số lượng chu kỳ: Trong thực tế người ta thưởng sử dụng 30 chu kỳ là tối ưu và không bao giờ vượt quá 40 chu kỳ. Sở dĩ như vậy vì phản ứng PCR diễn ra qua 2 giai đoạn: + Giai đoạn đầu: có số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu. + Giai đoạn sau: Số lượng bản sao giảm dần vì sự phân hủy làm cạn kiệt các thành phần tham gia phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ và các bản sao vừa tạo ra không kết hợp với mồi mà kết hợp với nhau. Số chu kỳ cho 1 phản ứng tùy thuộc số lượng bản mẫu ban đầu. Ví dụ nếu số lượng bản mẫu là 10 5 thì cần 25 – 30 chu kỳ; nếu số lượng bản mẫu là 10 2 – 10 3 thì số chu kỳ phải là 35 – 40 chu kỳ. II.1.2.1.3. Qui trình tiến hành PCR: – 7 – GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh Phương pháp PCR Quá trình thực hiện phương pháp PCR xảy ra theo chu kì thực hiện với các bước cơ bản sau : – Bước 1: Biến tính phân tử ADN khuôn tiến hành ở 94 0 C. Trước hết tiến hành xử lý mẫu ở 94 0 C trong 5 phút đầu để khởi đầu quá trình. Sau đó cứ đầu mỗi chu kỳ lại xử lý 94 0 C trong 30 phút để biến tính ADN. – Bước 2 : – 8 – GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh Kết hợp mồi vào khuôn cho các mồi vào với mẫu ADN đã biến tính rồi xử lý ở nhiệt độ 60 0 C trong 30 phút, ở nhiệt độ này các primer srx liên kết với ADN khuôn. – Bước 3 : Tổng hợp 2 chuỗi ADN. Cho nguyên liệu dNTP vào và xử llys ở nhiệt độ 72 0 C trong 1 phút, ở nhiệt độ này quá trình tổng hợp 2 chuỗi bổ sung cho 2 chuỗi ADN khuôn xảy ra. Sau khi kết thúc giai đoạn 3, tiếp tục quay lại chu kì với việc xử lý ở nhiệt độ 94 0 C trong 30 giây. Mọi thao tác đều được tiến hành trong phòng vô trùng. Mẫu thu được sẽ được cất giữ ở 4 0 C. II.1.2.2. Phương pháp tách chiết axit nucleic II.1.2.2.1. Phương pháp tách chiết axit nucleic * Phương pháp tách chiết ADN: – Các bước + Phá bỏ màng tế bào và màng nhân + Loại bỏ các tạp chất + Kết tủa axit nucleic – Quy trình tách chiết – 9 – GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh Mẫu Cố định mẫu bằng N 2 lỏng Mẫu mất hoạt tính enzim Nghiền với hỗn hợp phenol-Tris SDS Hỗn hợp Lọc Dịch Bã (bỏ đi) 4 0 C-24 h, lọc Dịch Bã (bỏ đi) Alcol 96 0 +Acetat Na1M -20 0 C-24 h Hỗn hợp Ly tâm 3000g/10 ‘ Tủa (Axit Nucleic tổng số) Dịch (bỏ đi) NaCl0,3M+Cetavlon 4 0 C-30 ‘ Hỗn hợp Ly tâm 3000g/10 ‘ Tủa (ARN) Dịch (ADN) * Phương pháp tách chiết ARN: – Các bước: + Phá bỏ màng tế bào + Tách protein ra khỏi hỗn hợp bằng xử lý phenol-chlorofform và ly tâm – 10 – […]… bệnh Hemophilia (Rối loạn máu di truyền), Ung thư và Muscular Dystrophy (Chứng loạn dưỡng cơ) Với tốc độ phát triển hiện nay của khoa học công nghệ nói chung và Sinh học phân tử nói riêng, chúng ta hoàn toàn có thể tin tưởng vào một thời đại công nghệ Sinh học phân tử trong tương lai, khi Y học ứng dụng các thành tựu mới của Sinh học phân tử vào việc chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe con người, chẩn đoán. .. tế – xã hội phát sinh các quan hệ huyết thống rắc rối… II.2.2 Xác định ADN bệnh lí Sinh học phân tử được sử dụng rộng rãi trong việc xác định bệnh lý Trong đó phương pháp PCR được ứng dụng nhiều Và phương pháp này được sử dụng trong chẩn đoán bệnh ung thư (tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gen APC trong ung thư đại tràng, gen BRCA 1 – BRCA 2 trong ung thư vú, gen TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ… bệnh mà bây giờ vẫn đang là bài toán khó đối với toàn nhân loại III.2 Đề nghị Những ứng dụng của Sinh học phân tử tìm hiểu được trong tiểu luận này đang còn sơ lược, chưa đầy đủ và còn nhiều thiếu sót Trên cơ sở này, có thể bổ sung và phát triển các đề tài về ứng dụng của Sinh học phân tử vào các chủ đề đề cụ thể hơn của Y học để có được những thông tin và cái nhìn toàn diện hơn về vai trò to lớn của. .. pháp chẩn đoán kinh điển khác (2) PCR đa mồi (multiplex-PCR) trong chẩn đoán phân tử xác định và phân biệt ký sinh trùng Đối với ký sinh trùng, cho đến nay đã có hàng chục phương pháp và kit chẩn đoán multiplex-PCR sử dụng phát hiện nhiều loài gây bệnh Khi ký sinh trùng cùng tồn tại ở một vị trí, một vùng trong cơ quan của cơ thể (ví dụ: cùng ở trong máu, cùng ở trong đường ruột/khoang ruột, cùng ở trong. .. riêng biệt của chúng bằng PCR – 35 – GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh Phần III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ III.1 Kết luận Sinh học phân tử phát triển đã có những đóng góp hết sức to lớn đảm bảo cho chất lượng cuộc sống của con người Nó đã tạo ra những bước tiến dài trong y học trong một thời gian ngắn, phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe cho mọi người Sinh học phân tử đã đã được ứng dụng rộng… Nguyễn Thị Thanh Vinh Trong vi sinh vật, phản ứng khuyếch đại DNA được ứng dụng rất sớm và ngày càng rộng rãi để chẩn đoán cǎn nguyên của các bệnh nhiễm trùng, ký sinh trùng và virus, để tìm hiểu sâu hơn về cơ chế gây bệnh của chúng và để phân loại chúng một cách chi tiết và chính xác hơn * Xác định cǎn nguyên của bệnh nhiễm trùng: Cǎn cứ vào các đặc điểm thường gặp nhất của vi sinh vật được quan tâm,… định hướng xuyên suốt trong chiến lược xây dựng phương thức và kit chẩn đoán bằng sinh học phân tử ở nước ta Do vậy, việc nghiên cứu chẩn đoán phân tử là hết sức bức thiết, đặc biệt là nghiên cứu kit PCR đa gen/đa mồi (multiplex-PCR) đối với ký sinh trùng mà chúng tôi đang xây dựng sẽ giúp cho việc chẩn đoán hoàn toàn chính xác và góp phần to lớn trong phòng chống bệnh có hiệu quả trong phạm vi cả nước… khoa vi trùng, bệnh viện St Vincent’s, Sydney, Australia, Viện Công nghệ sinh học của bệnh truyền nhiễm, đại học Kỹ thuật Sydney, Broadway, Australia, Khoa khoa học sinh học và y học, đại học Sydney, Broadway, Australia cùng tiến hành cho biết nghiên cứu của họ nhằm tiến hành xem xét sự có mặt của Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Entamoeba moshkovskii trong các mẫu phân tren bệnh nhân ở Sydney,… quan trọng khác, trong đó có sử dụng dữ liệu để thiết kế mồi cho multiplex PCR Ngoài ra còn có thể sử dụng các gen đích của hệ gen nhân trong chiến lược thiết kế phương pháp PCR đa gen/đa mồi để chẩn đoán phân biệt (3) Nghiên cứu ứng dụng PCR đa mồi xác định và phân biệt ký sinh trùng tại Việt Nam – 26 – GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh Nghiên cứu về sinh học phân tử giám định thành… (80%) bệnh phẩm dịch cổ tử cung của bệnh nhân được chẩn đoán “tổn thương tế bào gai mức độ thấp LSIL/HPV” được gửi từ Trung tâm chăm sóc sức khoẻ sinh sản tỉnh Bình định cho kết quả dương tính với PCR-HPV – 34/35 (97%) mẫu bệnh phẩm là u sùi sinh dục của bệnh nhân được chẩn đoán sùi mào gà cho kết quả dương tính với PCR-HPV và 100% thuộc type HPV-6/11 – Lấy ngẫu nhiên 30 mẫu bệnh phẩm là phết cổ tử cung. vào trong y học Sinh học phân tử là môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật hay các hiện tượng sinh học ở mức độ phân tử. Cũng như nhiều ngành khoa học khác, Sinh học phân tử trong thời gian qua. ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TIỂU LUẬN Đề tài: ỨNG DỤNG CỦA SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH” Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc Học viên thực hiện. mà Sinh học phân tử mang lại cho y học liên quan trực tiếp đến sức khỏe và đời sống của chúng ta và nó là vấn đề mang tính thời sự nên em chọn đề tài Ứng dụng của Sinh học phân tử chẩn đoán bệnh
Source: https://mindovermetal.org
Category: Ứng dụng hay
