Sinh lý thực vật ứng dụng

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (19.61 MB, 162 trang )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TR
ƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP I HÀ NỘI
***

Giáo trình

SINH LÝ THỰC VẬT ỨNG DỤNG

PGS.TS VŨ QUANG SÁNG (chủ biên)
NGUYỄN THỊ NHẪN, MAI THỊ TÂN, NGUYỄN KIM THANH

A

ð/C

+GA
3
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….1
LỜI NÓI ðẦU

Trong quá trình phát triển của mình, môn khoa học Sinh lý thực vật có hai hướng
nghiên cứu chính:
– Hướng nghiên cứu Sinh lý – Hoá sinh: chuyên nghiên cứu bản chất các quá trình sống
xảy ra trong cơ thể thực vật, từ ñó tìm ra các biện pháp ñiều khiển một phần hay toàn bộ
quá trình Sinh lý – Hoá sinh theo hướng có lợi cho con người trong ñiều kiện tự nhiên và
nhân tạo như nghiên cứu các quá trình quang hợp, cố ñịnh nitơ phân tử (N
2
) và quá trình
sinh trưởng, phát triển của cây v.v…
– Hướng nghiên cứu Sinh lý – Sinh thái: chuyên nghiên cứu mối quan hệ giữa các quá
trình sinh lý và các yếu tố sinh thái (nước, nhiệt ñộ, ánh sáng, O
2
, CO
2
và dinh dưỡng,
ñất…). Trên cơ sở ñó tìm ra ñược các quy luật hoạt ñộng của các quá trình sinh lý trong
các ñiều kiện sinh thái xác ñịnh nhằm xây dựng mô hình sinh thái tối ưu cho các quá trình
sinh lý giúp cây sinh trưởng, phát triển và cho năng suất cao, chất lượng tốt.
Sinh lý học thực vật còn ñược chia ra các chuyên khoa:
– Sinh lý thực vật ñại cương – Chuyên nghiên cứu các chức năng sinh lý chung của
thực vật.
– Sinh lý thực vật chuyên khoa – Nghiên cứu các quy luật sinh lý cho từng nhóm
cây, từng cây như Sinh lý cây trồng, Sinh lý cây rừng, Sinh lý cây ăn quả, Sinh lý cây lúa,

cây ñậu tương, Sinh lý cây ngô, cây khoai tây v.v…
– Sinh lý thực vật ứng dụng.
+ Cơ sở biên soạn giáo trình
Những năm gần ñây, Sinh lý học thực vật ngày càng tiếp cận với nhiệm vụ của thực tiễn
sản xuất nông nghiệp, lâm nghiệp, bảo quản và chế biến nông sản v.v… và nó có vai trò rất
quan trọng cho các ngành sản xuất này. Do khuôn khổ giáo trình Sinh lý thực vật cơ bản có
thời lượng giới hạn, không thể trình bày hết ñược những ứng dụng và khả năng ứng dụng
của môn khoa học này vào sản xuất, trong khi những vấn ñề ứng dụng vào thực tiễn sản
xuất người kỹ sư nông học rất cần ñược trang bị.Trước bối cảnh ñó môn học Sinh lý thực
vật ứng dụng ra ñời.
+ ðối tượng và nhiệm vụ của môn học Sinh lý thực vật ứng dụng.
Hiểu rõ nguyên lý và ứng dụng vào ñối tượng cây trồng. Vì vậy, nhiệm vụ chính của
Sinh lý thực vật ứng dụng là nghiên cứu, ứng dụng những quy luật sinh lý của cây trồng ñã
biết vào thực tiễn sản xuất như :
• Các kiến thức về Sinh lý tế bào ñã và ñang ñược ứng dụng rộng rãi, hiệu quả trong
công nghệ nhân giống vô tính cây trồng bằng con ñường nuôi cấy mô (in vitro),
giâm chiết cành (in vivo) ñể cung cấp cho sản xuất cây giống có chất lượng cao.
• Các kiến thức về trao ñổi nước và dinh dưỡng khoáng ñược ứng dụng vào việc
chuẩn ñoán nhu cầu nước, dinh dưỡng ñối với cây.Từ ñó có các biện pháp tưới
nước, bón phân hợp lý cũng như ứng dụng trong công nghệ trồng cây không dùng
ñất, góp phần tạo nên một nền nông nghiệp sạch và bền vững.
• Các kiến thức về quang hợp giúp chúng ta ñưa ra các biện pháp kỹ thuật ñiều khiển
hệ quang hợp trong quần thể cây trồng ñể “kinh doanh” năng lượng ánh sáng mặt
trời hiệu quả nhất.
• Những kiến thức về hô hấp ñưa ñến các biện pháp kỹ thuật bảo quản nông sản
phẩm và ngâm ủ hạt giống, làm ñất gieo hạt
• Sự hiểu biết về sinh trưởng, phát triển của thực vật cũng như các chất ñiều hoà sinh
trưởng thực vật ñã và ñang ñược ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp ñể ñiều
khiển cây sinh trưởng, phát triển theo hướng có lợi cho con người.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….2

Ngoài ra những kiến thức hiểu biết về Sinh lý học thực vật còn ñược ứng dụng trong
ñiều khiển và khai thác các hệ sinh thái tối ưu, liên quan ñến việc bảo vệ môi trường bền
vững.
+ Kết cấu của giáo trình sinh lý thực vật ứng dụng: gồm 7 chương
Chương I : Nhân giống vô tính cây trồng.
Chương II: ðiều khiển trao ñổi nước và dinh dưỡng khoáng ñối với cây trồng.
Chương III: Trồng cây không dùng ñất.
Chương IV: Quang hợp của quần thể cây trồng.
Chương V: ðiều khiển hô hấp trong trồng trọt và bảo quản nông sản phẩm.
Chương VI: Ứng dụng chất ñiều hoà sinh trưởng trong trồng trọt.
Chương VII: ðiều chỉnh phát sinh hình thái của cây.
Trong quá trình biên soạn giáo trình này chúng tôi ñã kết hợp những kiến thức của Sinh
lý học thực vật với sự hiểu biết về các ứng dụng và khả năng ứng dụng của môn học này
trong sản xuất. Do ñó cuốn giáo trình này không chỉ là tài liệu học tập cần thiết cho sinh
viên ngành nông học mà còn là tài liệu tham khảo cho tất cả những ai quan tâm ñến lĩnh
vực này.
Tuy nhiên, vì ñây là giáo trình biên soạn lần ñầu và thời gian có hạn, lượng thông tin có
thể còn hạn chế nên trong biên soạn không tránh khỏi những khiếm khuyết. Chúng tôi rất
mong nhận ñược sự góp ý của các chuyên gia và bạn ñọc ñể cuốn sách này ñược hoàn
thiện hơn.

ðể học tốt hơn môn học này, nên tham khảo thêm một số tài liệu sau:
1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội. Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến
giống cây trồng. NXB nông nghiệp, Hà Nội, 1997.
2. Trần Minh Tâm. Bảo quản và chế biến nông sản sau thu hoạch. NXB Nông nghiệp,
Hà Nội, 2002.
3. Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn. Chất ñiều hoà sinh trưởng với cây trồng.
NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 1993.
4. Vũ Văn Vụ. Sinh lý thực vật ứng dụng. NXB Giáo dục, Hà Nội, 1999.

Các tác giả.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….3
A. PHẦN LÝ THUYẾT
CHƯƠNG I
NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TRỒNG

– Nắm ñược các khái niệm và những ưu nhược ñiểm của các hình thức nhân giống thực
vật nói chung và nhân giống cây trồng nói riêng. Dựa vào khả năng nhân giống vô tính
thực vật trong tự nhiên ñể con người vận dụng vào thực tiễn sản xuất trong công tác nhân
giống vô tính cây trồng. Nắm ñược cơ sở khoa học và những ưu nhược ñiểm của các
phương pháp nhân giống vô tính cây trồng nhân tạo
– Kỹ thuật nhân giống vô tính cây trồng in vivo (phương pháp giâm, chiết cành; ghép
cành): những ưu nhược ñiểm, cơ sở khoa học của phương pháp, các thao tác cụ thể. Ứng
dụng của từng phương pháp trong sản xuất.

– Kỹ thuật nhân giống vô tính cây trồng in vitro (phương pháp nhân giống vô tính bằng
nuôi cấy mô tế bào): cơ sở khoa học, ưu nhược ñiểm, các ñiều kiện cần thiết trong kỹ thuật
nuôi cấy mô tế bào, kỹ thuật của từng giai ñoạn nuôi cấy mô tế bào. Ứng dụng vào thực
tiễn sản xuất
1. Một số khái niệm liên quan ñến nhân giống
* Sinh sản (Reproduction) : là khả năng sinh vật tái tạo các thế hệ. Phương thức sinh sản rất
ña dạng nhưng ñều thuộc hai hình thức chính là sinh sản hữu tính và sinh sản vô tính.
Sinh sản hữu tính (Secxual reproduction) là hình thức sinh sản có sự kết hợp của giao
tử ñực và cái ñể tạo thành phôi, sau ñó phát triển thành cơ thể mới hoàn chỉnh. Sinh sản
hữu tính có thể là tự phối hoặc tạp giao.
Sinh sản vô tính (Asecxual reproduction) là hình thức sinh sản không có sự kết hợp
của giao tử ñực và cái. Sinh sản vô tính ở cây trồng có các hình thức sau :
Sinh sản vô phối (Agamic reproduction): phôi ñược tạo ra không do thụ tinh giữa tế
bào trứng và tinh trùng, ñây là hiện tượng tự nhiên ñể tạo ra dòng vô tính thông qua hạt
giống.
Sinh sản sinh dưỡng (Vegetative reproduction): là khả năng tái tạo một cơ thể mới
hoàn chỉnh từ một bộ phận nào ñó ñược tách rời khỏi cơ thể mẹ như thân, rễ, lá, củ, chồi
Trong tự nhiên, nhiều loại cây trồng có thể sinh sản vừa bằng hình thức hữu tính, vừa
bằng hình thức vô tính, nhưng cũng có nhiều loại cây trồng chỉ sinh sản bằng hình thức
hữu tính hoặc vô tính
* Nhân giống (Propagation): là biện pháp kỹ thuật mà con người dùng ñể tái tạo các cá
thể cần thiết thông qua hệ thống sinh sản. Vì vậy, có thể sử dụng hình thức nhân giống
bằng phương pháp hữu tính hoặc phương pháp vô tính tuỳ vào mục ñích cũng như các loại
cây trồng.
2. Nhân giống cây trồng bằng phương pháp hữu tính
+ Khái niệm : nhân giống bằng phương pháp hữu tính là hình thức cây con ñược hình
thành từ hạt. Ðây là hình thức nhân giống cổ truyền mà con người sử dụng từ khi biết trồng
trọt. Hạt là ñược hình thành do kết quả thụ tinh giữa giao tử ñực (hạt phấn) với giao tử cái
(noãn). Từ hạt sẽ hình thành một cây mới mang ñặc tính của cả cây bố và cây mẹ (trong
trường hợp thụ phấn chéo) hoặc nghiêng hẳn về cây bố hoặc cây mẹ (trong trường hợp vô

phối). Hạt ñược hình thành do quá trình tự thụ phấn của hoa hoặc do thụ phấn nhân tạo.
+ Những ưu ñiểm
Ưu ñiểm của phương pháp nhân giống hữu tính ñã ñược Edwin .F. George (1993) tổng
kết thành bốn ñiểm chính sau:
– Phương pháp tiến hành ñơn giản trong tự nhiên hoặc nhân tạo mà không cần sử dụng
dụng cụ thiết bị phức tạp. Ðồng thời, phương pháp nhân giống hữu tính tạo nên ñược một
số lượng lớn cây giống nên giá thành cây giống thường rẻ.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….4
– Hạt giống có thể bảo quản ñược trong thời gian dài trong các dụng cụ ñơn giản như
bao bì, chum, vại, chai, lọ tuỳ thuộc từng loại hạt và sự rủi ro trong quá trình bảo quản
thấp, hạt giống ñảm bảo tỷ lệ sống cao.
– Dễ dàng vận chuyển và phân phối khối lượng lớn hạt giống từ nơi sản xuất ñến nơi
tiêu thụ.
– Các loại sâu bệnh và virut phần lớn là không lây truyền qua hạt nên cây giống mọc từ
hạt là cây sạch bệnh.
+ Những nhược ñiểm
Nhược ñiểm lớn nhất của phương pháp nhân giống hữu tính là ña số cây con ñược sinh
ra từ hạt sẽ có những tính trạng thay ñổi so với cây mẹ, mỗi một sự thay ñổi ñó là ñại diện
của một tổ hợp gen mới ñược hình thành trong quá trình phân bào giảm nhiễm. Vì vậy cây
nhân giống bằng phương pháp hữu tính thường không ñồng ñều và không hoàn toàn mang
các tính trạng như cây mẹ.
Ðối với loại cây ăn quả, cây công nghiệp dài ngày thì nhân giống bằng phương pháp
hữu tính ngày càng giảm, người ta chỉ áp dụng hình thức này trong các trường hợp khó
thành công trong phương pháp nhân giống vô tính, các loại cây có hạt ña phôi, sử dụng cho
công tác lai tạo và chọn lọc giống.
3. Nhân giống cây trồng bằng phương pháp vô tính
Khái niệm : nhân giống vô tính cây trồng là phương pháp tạo cây con từ các cơ quan, bộ
phận dinh dưỡng của cây như cành, thân, rễ, lá, củ Ðây là hình thức nhân giống phổ biến ở
nhiều loại cây trồng. Quá trình nhân giống vô tính có thể diễn ra trong tự nhiên và nhân tạo.
3.1 Nhân giống vô tính tự nhiên

Là hình thức nhân giống mà con người lợi dụng khả năng sinh sản dinh dưỡng của cây
trồng, lợi dụng khả năng phân chia các cơ quan dinh dưỡng của cây trồng ñể hình thành
một cá thể mới có khả năng sống ñộc lập với cây mẹ và mang các tính trạng của cây mẹ.
Hình thức này bao gồm :
* Dùng thân bò lan :
Ở phần mắt giữa hai lóng, nếu ñược tiếp xúc
với ñất sẽ mọc rễ, phía trên mọc chồi ñể tạo thành
một cây con hoàn chỉnh, tách rời khỏi cơ thể mẹ
ñem trồng thành một cây mới.
Biện pháp này thường áp dụng ñối với một số
loại cây có tia thân như cây dâu tây. Biện pháp này
rất ñơn giản vì loại cây này khi tia thân bò ñến ñâu
thì mỗi ñốt sẽ hình thành một cây mới, ta chỉ việc
tách các cây mới ñem trồng (hình 1.1).

Hình 1.1: Thân bò lan
* Tách chồi : Chồi ñược hình thành từ gốc thân chính có ñầy ñủ thân, lá, rễ. Tuỳ từng
loại cây trồng mà có các loại chồi khác nhau như chồi thân (chuối), chồi ngầm (khoai
nước, sen), chồi cuống quả, chồi chóp quả (dứa). Các chồi nay sau khi tách khỏi cơ thể mẹ
có thể ñem trồng ngay hoặc qua giai ñoạn vườn ươm.
* Nhân giống bằng thân củ, thân rễ (thân sinh ñịa) : Trên thân của loại cây sinh ñịa
có mang các chồi hoặc nhiều mắt chồi, mỗi mắt có thể phát triển thành chồi và thành cây
hoàn chỉnh, do vậy có thể dùng cây sinh ñịa ñể nhân giống như hành, khoai tây, gừng,
hoàng tinh
3.2. Nhân giống vố tính nhân tạo
Là hình thức nhân giống vô tính có sự tác ñộng của các biện pháp cơ học, hoá học, công
nghệ sinh học ñể ñiều khiển sự phát sinh các cơ quan bộ phận của cây như rễ, chồi, lá
hình thành một cây hoàn chỉnh hoàn toàn có khả năng sống ñộc lập với cây mẹ. Cây ñược

tạo nên từ phương thức nhân giống này mang hoàn toàn ñặc tính di truyền như cây mẹ.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….5
Người ta phân chia làm hai loại :
-Nhân giống vô tính ñược thực hiện trong ñiều kiện tự nhiên (in vivo), với hình thức
này, cây giống tạo ra có kích thước lớn (Macro propagation)
-Nhân giống vô tính ñược thực hiện trong phòng thí nghiệm (in vitro), với hình thức
này cây giống có kích thước nhỏ (Micro propagation).
4. Nhân giống vô tính in vivo (Macro propagation)
Nhân giống vô tính in vivo tức là quá trình nhân giống ñược thực hiện trong ñiều kiện
tự nhiên gồm các hình thức như tách cây, giâm cành, chiết cành, ghép mắt ñể tạo cây con
có ñặc tính giống hệt cây mẹ.
* Cơ sở khoa học
Tất cả các loại thực vật ñều có ñặc tính tái sinh, tức là, khi tách rời một cơ quan bộ
phận nào ñó của cây ra khỏi cây mẹ thì lúc ñó trạng thái nguyên vẹn của cây bị vi phạm,
nhờ có ñặc tính tái sinh mà cây có khả năng khôi phục lại trạng thái nguyên vẹn của mình.
Ðặc tính tái sinh ở thực vật lớn hơn ñộng vật rất nhiều. Vận dụng ñặc tính tái sinh của thực
vật mà con người ñiều khiển cây trồng theo hướng có lợi như biện pháp cắt tỉa tạo tán cho
cây cảnh, cây lấy búp ; nhân giống vô tính cây trồng Trong biện pháp nhân giống vô tính
cây trồng thì khả năng ra rễ bất ñịnh của cành chiết, cành giâm hoặc liền vết ghép ñều dựa
vào ñặc tính tái sinh ñể ñảm bảo tính nguyên vẹn của cây.
Khi tách một cành ra khỏi cây mẹ thì cây ñó ñã bị mất tính nguyên vẹn của mình, ñể
khôi phục lại tính nguyên vẹn của mình, cây có khả năng sinh ra một chồi mới ñể bù ñắp
cành vừa mất ñi. Ðồng thời cành ñược tách ra khỏi cây mẹ lúc ñó cũng bị mất tính nguyên
vẹn của một cây, tức là, cành bị thiếu phần rễ ñể trở thành cây hoàn chỉnh, nên nó sẽ tự
khôi phục tính nguyên vẹn của mình bằng khả năng hình thành rễ bất ñịnh ñể trở thành cây
hoàn chỉnh. Hoặc khi ghép mắt thì nhờ khả năng tái sinh của các tế bào xung quanh phần
bị cắt ñã làm liền vết thương và tiếp nhận mắt ghép.
* Ưu ñiểm của phương pháp nhân giống vô tính in vivo
Nhân giống vô tính in vivo bằng các biện pháp giâm cành, chiết cành và ghép mắt có
một số ưu ñiểm chính sau :

– Tỷ lệ thành công trong nhân giống cao. Các biện pháp giâm, chiết cành hoặc ghép mắt
tỷ lệ tạo cây giống thường ñạt ñược từ 50% ñến 100% tuỳ theo từng ñối tượng cây trồng và
các biện pháp áp dụng. Hiện nay, người ta thường sử dụng các chất ñiều tiết sinh trưởng ñể
khích thích sự ra rễ bất ñịnh cho cành chiết cành giâm thì tỷ lệ ra rễ ñạt tới 100%.
– Thời gian tạo cây giống nhanh. Thông thường thời gian tạo cây giống trong kỹ thuật
giâm, chiết cành hoặc ghép mắt chỉ từ vài ngày ñến vài tháng tuỳ theo từng ñối tượng cây
trồng và biện pháp áp dụng. Bộ môn Sinh lý thực vật- Trường ñại học Nông Nghiệp I rất
thành công trong kỹ thuật giâm cành của nhiều loại ñối tượng cây trồng như cây khoai tây,
cẩm chướng, cây roi, bưởi, chanh chỉ sau từ 3 ñến 7 ngày thì cành giâm ra rễ bất ñịnh và
sau khoảng 1- 4 tuần thì cây giống ñủ tiêu chuẩn xuất vườn.
– Tạo cây giống có kích thước lớn. Cây giống ñược tạo bằng biện pháp giâm, chiết cành
hoặc ghép mắt có kích thước lớn hơn nhiều so với phương pháp nhân giống in vitro. Kích
thước của cây giống khoảng từ một ñốt ñến nhiều ñốt cây tuỳ thuộc vào ñối tượng cây
trồng và nhu cầu của hệ số nhân giống.
– Cây giống mang ñặc tính của cây mẹ. Biện pháp giâm chiết cành và ghép mắt cũng
như các biện pháp nhân giống vô tính nói chung, cây giống tạo thành từ các cơ quan dinh
dưỡng của cây mẹ nên có tuổi sinh học của cây mẹ và mang ñặc tính di truyền của cây mẹ.
– Thao tác và trang thiết bị ñơn giản. Kỹ thuật nhân giống vô tính bằng biện pháp giâm,
chiết cành hoặc ghép mắt rất dễ dàng áp dụng cho mọi ñối tượng lao ñộng trong nghề làm
vườn. Mọi thao tác trong quy trình giâm chiết cành hoặc ghép mắt rất ñơn giản và hoàn
toàn không yêu cầu các thiết bị hiện ñại.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….6
4.1. Nhân giống vô tính bằng tách cây
Mỗi cây thường chỉ có một gốc và một bộ rễ, tuy nhiên, con người có thể sử dụng các
biện pháp kỹ thuật tác ñộng ñể cây phát sinh nhiều gốc, mỗi gốc có bộ rễ riêng biệt, rồi
tách riêng từng gốc ñem trồng thành cây mới. Ví dụ biện pháp cưa gốc cho nảy chồi rồi
vun ñất vào gốc cho ra rễ, tách ra trồng. Phương pháp này chậm, hiệu quả thấp, tốn công
nên ít ñược áp dụng.
4.2. Nhân giống vô tính bằng giâm, chiết cành
Phương pháp giâm, chiết cành dựa trên khả năng hình thành rễ bất ñịnh của cành giâm

hoặc chiết khi ñược cắt rời khỏi cây mẹ. Phương pháp này thường ñược áp dụng cho cả hai
nhóm cây thân gỗ và thân thảo như cây vải, nhãn, cam, chanh, khoai tây, mía, dứa, hoa
cúc, cẩm chướng
* Cơ sở khoa học của sự hình thành rễ bất ñịnh
Khi có tác ñộng vào cây mẹ như cắt cành giâm ra khỏi cơ thể cây mẹ hoặc khoanh vỏ
cành chiết thì lúc ñó trong cơ thể cây mẹ sẽ bắt ñầu hoạt hoá sự hình thành rễ bất ñịnh. Yếu
tố gây hoạt hoá sự hình rễ bất ñịnh là auxin.
Khi có tác ñộng cắt cành hoặc khoanh vỏ thì auxin sẽ ñược hình thành một cách nhanh
chóng tại ñỉnh sinh trưởng và các cơ quan non, sau ñó qua hệ thống mạch libe auxin ñược
vận chuyển về phần vết cắt của cành chiết, cành giâm ñể kích thích tạo rễ bất ñịnh. Vì vậy,
sự ra rễ bất ñịnh của cành chiết, cành giâm nhanh hay chậm là hoàn toàn phụ thuộc vào
khả năng tổng hợp auxin nội sinh của từng loại cây trồng. Người ta có thể xử lý bổ sung
auxin ngoại sinh ñể thúc ñẩy nhanh chóng sự ra rễ bất ñịnh của cành chiết, cành giâm.
Sự hình thành rễ bất ñịnh là một quá trình, ñó là quá trình phản phân hoá của tế bào
tiền tượng tầng, tiếp ñó là tái phân hoá ñể hình thành mầm rễ (hình 2.1)
Quá trình hình thành rễ bất ñịnh chia làm ba giai ñoạn :
– Phản phân hoá của tế bào tiền tượng tầng ñể trở lại chức năng phân chia tế bào của
mô phân sinh tượng tầng ñể tạo khối tế bào bất ñịnh (callus)
– Tái phân hoá tế bào rễ từ các tế bào bất ñịnh ñể hình thành mầm rễ bất ñịnh
– Mầm rễ sinh trưởng ñể hình thành rễ bất ñịnh.
Thông thường, giai ñoạn ñầu của sự hình thành rễ bất ñịnh cần lượng auxin lớn nhất
cho sự phản phân hoá tế bào (10
-4
– 10
-5
g/cm
3
), giai ñoạn thứ hai cần lượng auxin thấp hơn
cho sự tái phân hoá mầm rễ (10
-7

g/cm
3
), còn giai ñoạn sinh trưởng rễ lượng auxin cần rất
thấp (10
-11
– 10
-12
g/cm
3
) hoặc không cần auxin trong giai ñoạn này.

a b
Hình 2.1: Sự phản phân hoá tế bào tượng tầng ñể hình thành rễ bất ñịnh
a, b. Lát cắt dọc và cắt ngang mầm rễ bất ñịnh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….7
Trong kỹ thuật giâm, chiết cành, người ta thường xử lý bổ sung các chất thuộc nhóm
auxin ngoại sinh ñể kích thích sự tạo rễ bất ñịnh nhanh và hiệu quả hơn như IBA, α-NAA,
2,4D Tuỳ theo chất sử dụng và loại cây trồng, cũng như tuỳ theo phương pháp xử lý mà nồng ñộ
sử dụng là khác nhau.
Có ba phương pháp chính ñể xử lý auxin cho sự ra rễ bất ñịnh:
– Phương pháp xử lý nồng ñộ loãng: nồng ñộ xử lý vào khoảng vài chục ppm.
Với phương thức giâm cành thì ngâm phần gốc vào dung dịch trong thời gian 12 ñến
24 giờ rồi cắm cành giâm vào giá thể.
Với phương thức chiết cành thì trộn dung dịch xử lý với ñất bó bầu trước khi bó bầu
xung quanh vết khoanh vỏ.
– Phương pháp xử lý nồng ñộ ñặc: nồng ñộ xử lý khoảng vài nghìn ppm.
Với phương thức giâm cành thì nhúng rất nhanh phần gốc vào dung dịch trong khoảng
1-2 giây rồi cắm ngay vào giá thể
Với phương thức chiết cành thì dùng bông tẩm dung dịch xử lý và chỉ cần bôi lên trên

vết khoanh vỏ trên (nơi sẽ xuất hiện rễ) trước khi bó bầu
– Sử dụng dạng bột: có nhiều chế phẩm giâm chiết cành dạng bột, trong thành phần có
chứa auxin với một tỷ lệ nhất ñịnh ñược phối trộn với một loại bột nào ñó. Khi giâm cành
chỉ cần chấm vết cắt của cành giâm vào chế phẩm bột rồi cắm vào giá thể.
a. Nhân giống vô tính bằng chiết cành
* Ưu ñiểm :
– Cây con dễ sống, sinh trưởng nhanh, mọc khoẻ
– Cây con mang ñầy ñủ ñặc tính di truyền của cây mẹ
– Cây thấp, tán gọn nên thuận tiện cho chăm sóc và thu hoạch
* Nhược ñiểm :
– Hệ số nhân giống không cao, chỉ sử dụng trong sản xuất nhỏ
– Cây nhanh già cỗi, tuổi thọ vườn cây thấp, khả năng chống chịu với ñiều kiện bất lợi
của môi trường không cao
– Cây mẹ bị khai thác nhiều sẽ làm giảm tuổi thọ và sức sống
* Các hình thức chiết cành
+ Chiết cành bằng biện pháp uốn vít cành
Biện pháp uốn cành thường áp dụng cho
ñối tượng cây thân bụi, thân thảo như cây
ñỗ quyên, kim ngân, ráy thơm
Cách tiến hành : uốn vít cành xuống rồi
phủ ñất lên, sau một thời gian phần ñược
phủ ñất sẽ ra rễ (hình 3.1). Ðể kích thích ra
rễ nhanh có thể gây vết thương nhẹ lên
cành uốn tại phần phủ ñất. Cắt rời từng
phần ñã ra rễ ñể tạo cây giống mới.

Hình 3.1: Biện pháp uốn vít cành
+ Chiết cành trên cây
Ðây là biện pháp áp dụng phổ biến cho nhóm cây thân gỗ như loại cây ăn quả nhãn, vải

hồng xiêm, chanh, roi, cam, quýt, bưởi ; nhóm cây công nghiệp như chè, cà phê ; nhóm
cây rừng như bạch ñàn, quế, hương cành vẫn ở trên cây từ khi ñược chiết ñến khi ra rễ
bất ñịnh tạo cây hoàn chỉnh mới cắt xuống ñem trồng.
Theo học thuyết chu kỳ tuổi của Trailakhyan thì mỗi cành ở trên cây có tuổi sinh học
khác nhau. Nếu cành có tuổi sinh học trung bình sẽ có khả năng tạo rễ bất ñịnh tốt hơn
những cành có tuổi sinh học quá lớn hoặc quá nhỏ. Vì vậy, với mục ñích nhân giống vô
tính bằng kỹ thuật chiết cành người ta thường lựa chọn những cành trên cây có tuổi sinh
học trung bình hay còn gọi là cành bánh tẻ ñể chiết.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….8
Cách tiến hành: dùng dao sắc cắt hai khoanh vỏ cách nhau khoảng 2-3 cm (hình 4.1.
a,b) sau ñó loại bỏ lớp vỏ ngoài, dùng dao sắc cạo sạch lớp vỏ trắng tiếp theo ñến tận phần
gỗ (hình 4.1.c).

Hình 4.1:
Cách khoanh vỏ cành chiết
a,b. khoanh vỏ c. Bóc và cạo sạch lớp vỏ

Thường ñể phơi cành khoảng một buổi
hoặc một ngày sau mới bó bầu.
Ðối với những cây khó ra rễ như cây hồng
xiêm, mận, mơ, mít trước khi bó bầu ta nên
xử lý cho vết khoanh vỏ (vết khoanh trên)
dung dich auxin (α-NAA) 4000 -8000 ppm
hoặc trộn dung dich auxin vào hỗn hợp bó bầu
với nồng ñộ thấp hơn (40 – 100 ppm).
Nguyên liệu dùng ñể bó bầu thường sử
dụng là hỗn hợp giữa ñất vườn hoặc ñất bùn ao
phơi khô, ñập nhỏ trộn với một trong số
nguyên liệu hữu cơ như trấu bổi, mùn cưa, rơm
rác mục, rễ bèo tây với tỷ lệ 2/3 ñất với 1/3

nguyên liệu hữu cơ.
Ðảm bảo 70% ñộ ẩm của hỗn hợp bó bầu.
Phía ngoài của bầu chiết bọc bằng giấy PE
trong. Buộc chặt hai ñầu bầu chiết vào cành ñể
bầu không bị xoay xung quanh cành chiết
(hình 5.1).

Hình 5.1: Cách bó bầu cành chiết

a b
Hình 6.1: Sự ra rễ bất ñịnh của cành chiết ñủ tiêu chuẩn cắt
a. Ra rễ bất ñịnh b. Cắt cành chiết
Sau ñó theo dõi qua lớp PE khi thấy rễ ñã mọc ra phía ngoài bầu và chuyển màu trắng
nõn sang màu trắng ngà hoặc hơi ngả màu xanh thì có thể cưa cành chiết ñể trồng vào
vườn ươm (hình 6.1. a,b)
b. Nhân giống vô tính bằng giâm cành
* Ưu ñiểm :
– Cây con giữ ñựơc các tình trạng di truyền của cây mẹ, vườn cây ñồng ñều thuận tiện
chăm sóc, thu hoạch
– Thời gian nhân giống tương ñối nhanh, hệ số nhân giống cao
– Chu kỳ khai thác ngắn, hiệu quả kinh tế cao
B
ọc giấy
PE trong

H
ỗn hợp bó
bầu chiết

Giây buộc

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….9
* Nhược ñiểm :
– Tuổi thọ vườn cây thấp, chu kỳ kinh doanh ngắn
– Ðòi hỏi người sản xuất có trình ñộ kỹ thuật nhất ñịnh
– Tốn nhiều công chăm sóc
* Các hình thức giâm cành
Tuỳ theo từng ñối tượng cây trồng và mục ñích nhân giống mà người ta áp dụng các
hình thức giâm cành khác nhau. Sau ñây là một số biện pháp giâm cành phổ biến cho các
ñối tượng cây trồng :
+ Giâm cành bằng biện pháp cắt cành hoặc cắt thân.
Ðây là biện pháp áp dụng phổ biến cho nhiều ñối tượng cây trồng, các loại cây thân gỗ
như cây nhãn, vải, cam, chanh, bưởi, cà phê, chè ; các loại cây rau, cây hoa thân thảo như
khoai tây, hoa cúc Một số cây có thể thực hiện nhân giống bằng phương pháp cắt cành
hoặc cắt thân quanh năm. Trong khi ñó một số cây ñặc biệt là một số cây thân gỗ chỉ có thể
thực hiện vào mùa rụng lá khi mà cây ñang ở trạng thái ngủ nghỉ.
Cách tiến hành : dùng dao sắc cắt vát ở vị trí phía dưới của ñốt cành hoặc ñốt thân với
kích thước tuỳ thuộc vào từng ñối tượng cây trồng và mục ñích nhân giống. Có thể cắt
từng ñốt ñơn hoặc ñốt kép (ñối với cây có lá ñối xứng) (hình 7.1. a,b,c,d). Loại bỏ bớt một
phần của lá nếu lá quá to. Nhúng nhanh auxin (α-NAA vài nghìn ppm) vào vết cắt nếu cần
thiết, sau ñó cắm vào giá thể giâm cành với chiều sâu khoảng 1cm hoặc ñặt nằm ngang lấp
1/2 thân vào giá thể (ñối với cây mía, ñay, mây ). Ðảm bảo ñộ ẩm thích hợp của giá thể
và ñộ ẩm bão hoà trên bề mặt lá ñến khi xuất hiện rễ bất ñịnh của cành giâm. Chăm sóc
cẩn thận ñến khi xuất vườn.

(a)
(b) (c) (d)
Hình 7.1: Giâm cành bằng các biện pháp cắt cành, cắt thân
a. Cắt cành ; b. Cắt thân nằm ngang ; c. Cắt ñốt ñơn ; d. Cắt ñốt kép

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….10

Hình 8.1: Giâm cành bằng biện pháp cắt lá
a. Giâm lá nguyên vẹn b. Giâm mẩu lá

+ Giâm cành bằng biện pháp cắt lá
Biện pháp này ñược áp dụng ñối với các loại cây cảnh, cây trồng chậu trong nhà, ñặc
biệt thường sử dụng ñối với cây lá bỏng. Có hai loại kiểu cắt lá : cắt toàn bộ lá và cắt mẩu
lá (hình 8.1. a,b). Khi lá ñược cắt rời khỏi cây mẹ thì rễ bất ñịnh sẽ ñược hình thành tại
phần cuống lá hoặc trực tiếp trên lá.
Cách tiến hành : Biện pháp này mọi thao tác và quy trình tiến hành cũng tương tự như
biện pháp cắt cành ñã nêu ở trên nhưng chỉ dùng phần lá cây ñể giâm.
Dùng dao sắc cắt một mẩu lá cây hoặc cả lá cây gồm cả phần cuống hoặc không có
cuống tuỳ theo từng loại cây, sau ñó xử lý auxin vào vết cắt nếu cần thiết. Ðặt mẩu lá hoặc
cắm phần cuống lá vào giá thể. Sau một thời gian trên lá hoặc tại phần cuống sẽ hình thành
rễ bất ñịnh. Nếu phần cuống lá có cả mắt ngủ thì mắt ngủ sẽ bật chồi hình thành cây hoặc
cũng có thể tự trên phần lá hình thành chồi mới ñể thành cây mà không cần có mắt ngủ.

Trong kỹ thuật giâm cành cần chú ý :
– Giá thể là cát ẩm dùng ñể giâm cành là tốt nhất, có nhiều loại cát như cát thô, cát mịn,
cát ñen, cát vàng tuỳ theo từng ñối tượng cây trồng mà sử dụng loại cát nào cho thích
hợp. Cát có ñặc tính trơ, thoát nước và xốp sẽ tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự ra rễ. Cát dùng
làm giá thể phải sạch ñể tránh nấm, khuẩn hoặc các tạp chất làm chết cành giâm. Thường
sử dụng loại cát mới khai thác hoặc cát cũ thì phải ñược rửa sạch bằng cách ngâm cát trong
HCl hoặc thuốc tím trong vài giờ sau ñó rửa nhiều lần dưới vòi nước
– Cành mới giâm vẫn xảy ra quá trình thoát hơi nước trên bề mặt lá nhưng cành giâm
chưa có rễ ñể hút nước dẫn ñến mất cân bằng nước, cành giâm bị héo và chết. Vì vậy, cần
phải thường xuyên phun ẩm ñảm bảo ñộ ẩm bão hoà trên bề mặt lá làm giảm sự thoát hơi
nước cho ñến khi cành giâm xuất hiện rễ bất ñịnh
4.3. Nhân giống vô tính bằng phương pháp ghép
Ghép là phương pháp ñược thực hiện bằng cách lấy một bộ phận của những cây giống
tốt, ñang sinh trưởng như ñoạn cành, ñoạn rễ, mầm ngủ lắp ñặt vào vị trí thích hợp trên
cây khác gọi là gốc ghép ñể tạo thành một tổ hợp ghép, cùng sinh trưởng phát triển và tạo
nên một cây mới hoàn chỉnh.
a. Cơ sở khoa học của phương pháp ghép
Phương pháp ghép dựa vào ñặc tính tái sinh liền vết thương của cây. Tế bào tại phần bị
thương trên cây có khả năng tái phân chia liên tục thành một ñám tế bào ñể liền vết thương
và tiếp nhận phần ñược ghép vào cây.
Khi ghép cần áp sát phần mô phân sinh tượng tầng của phần ghép với gốc ghép, tại ñó
mô phân sinh của gốc ghép hoạt ñộng mạnh làm lấp ñầy chỗ trống giữa hai vết cắt, các tổ
chức mô tế bào của phần ghép và gốc ghép dần dần hoà hợp, gắn với nhau. Hệ thống mạch
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….11
floem và xylem dần ñược liên kết lại với nhau và thông suốt. Lúc này, chồi ghép ñược
cung cấp chất dinh dưỡng và nước nên bắt ñầu sinh trưởng, gốc ghép và chồi ghép trở
thành một cơ thể mới.
Cây nhân giống bằng phương pháp ghép vẫn hoàn toàn giữ ñược những tính trạng như
cây mẹ.
b. Mục ñích và các ưu nhựơc ñiểm của phương pháp ghép

*Mục ñích
– Nhân giống vô tính cây trồng trong trường hợp các phương pháp nhân giống khác khó
thực hiện hoặc kém hiệu quả.
– Thay ñổi một phần hoặc một bộ phận của cây này bằng một phần hoặc bộ phận của
cây giống khác.
– Tận dụng những ưu ñiểm của gốc ghép cho các cây trồng cần nhân giống
– Cải tạo những phần bị hại (gãy, sâu bệnh) của cây
– Sử dụng phương pháp ghép ñể test cây chống chịu bệnh
* Ưu ñiểm :
– Giữ ñược hầu hết các tính trạng của cây mẹ
– Hệ số nhân giống cao, cây ghép có tuổi thọ cao
– Có khả năng thay ñổi giống khi cần mà không phải trồng mới (giống cũ, năng suất
thấp, sâu bệnh ) hoặc cứu chữa các bộ phận hỏng (bị hại ở gốc, rễ dẫn tới chết toàn cây
thì ghép ñể thay rễ)
– Khai thác các ưu ñiểm của cây làm gốc ghép như : khả năng sinh trưởng, khả năng
chống chịu sâu bệnh và ñiều kiện ngoại cảnh bất lợi (hạn, úng, lạnh )
– Sử dụng trong công tác lai giống
* Nhược ñiểm :
– Cây sử dụng làm gốc ghép thường trồng bằng hạt nên sinh trưởng không ñồng ñều khó
chăm sóc
-Cần ñội ngũ kỹ thuật có trình ñộ am hiểu về kỹ thuật ghép, giống cây trồng
– Cần ñầu tư nhiều công sức ñể chọn tổ hợp ghép thích hợp tuỳ theo từng loại cây trồng
và từng vùng nhất ñịnh
c. Phương pháp ghép mắt
Trong kỹ thuật ghép, có một số hình thức ghép khác nhau như ghép áp, ghép cành,
ghép mắt. Tuỳ theo từng ñối tượng cây trồng và mục ñích ghép ñể lựa chọn hình thức ghép
thích hợp. Với mục ñích nhân giống vô tính cây trồng thường sử dụng hình thức ghép mắt.
Ghép mắt có nhiều kiểu ñược gọi theo vết rạch phần gốc ghép : ghép nêm, ghép chữ T, U,
H, I,
* Ưu ñiểm của phương pháp : ghép mắt là hình thức ghép rất phổ biến, áp dụng ñược

cho nhiều loại giống cây trồng khác nhau. Thao tác ñơn giản, thuận tiện. Hệ số nhân giống
cao. Dễ dàng bảo quản và vận chuyển vật liệu ghép.
* Cách tiến hành :
– Lấy mắt ghép : chọn mắt ghép trên cành “bánh tẻ”, không bị sâu bệnh (hình 9.1).
Tách mắt ghép theo kiểu bóc vỏ (cành táo ), hoặc cắt vát phần mắt (cành chanh, bưởi,
cam ) (hình 10.1 a,b,c,d)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….12

Hình 9.1: Chọn
mắt ghép trên cành
“bánh tẻ

a b c d
Hình 10.1 a,b : Tách mắt ghép trên Hình 10.1 c,d : Tách mắt ghép trên
cây thân gỗ cây họ cam chanh

Hình 11.1: Buộc
chặt mắt ghép vào
gốc ghép

a b
Hình 12.1. a,b: Mắt ghép sau khi tháo dây buộc (a) và nảy chồi (b)
– Chuẩn bị gốc ghép : dùng dao sắc mở “cửa sổ” phần vỏ của thân cây. Bóc miếng vỏ
trên vết khía. Tiến hành ñặt mắt ghép vào phía trong “của sổ” và ñậy cửa sổ bằng lớp vỏ
mới tách, cuốn chặt phần ghép bằng dây nilon mỏng (tránh ñể nước mưa gấm vào bên
trong) (hình 11.1). Sau khoảng 15-20 ngày có thể mở dây buộc và cắt miếng vỏ ñậy phía
ngoài miếng ghép (hình 12.1 a,b). Ðể kích thích mắt ngủ mọc mầm nhanh, sau khi mở dây

buộc khoảng 7 ngày tiến hành cắt ngọn gốc ghép. Thường cắt ngọn gốc ghép cách mắt
ghép khoảng 2-3 cm, nên cắt nghiêng khoảng 45
o
về phía ngược chiều với mắt ghép ñể
tránh nước nhỏ vào mắt ghép. Phương pháp ghép “cửa sổ” có tỷ lệ sống cao khoảng từ 70-
100% tuỳ theo từng loại cây.
5. Nhân giống vô tính in vitro (Micro propagation)
Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micro propagation) là một
lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ðây là
phương pháp nhân giống hiện ñại ñược thực hiện trong phòng thí nghiệm nên còn gọi là
phương pháp nhân giống trong ống nghiệm.
Khác với các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc ghép
mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn, có thể tạo ra
một số lượng cây giống lớn ñồng ñều ñể phủ kín một diện tích ñất nhất ñịnh mà các phương
pháp nhân giống khác không thể thay thế ñược. Ngoài ra phương pháp này không phụ thuộc
vào ñiều kiện thời tiết nên có thể tiến hành quanh năm. Ðây là một hướng ñang ñược ứng dụng
rộng rãi. Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản
xuất cây giống hàng nam ñã cung cấp một lượng ñáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản
xuất như chuối, dứa, khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp.
5.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nhân giống vô tính in vitro
Kỹ thuật nuôi cây mô tế bào (tissue culture) nói chung và kỹ thuật nhân giống vô tính in
vitro nói riêng ñều dựa vào cơ sở khoa học là có tính toàn năng, sự phân hoá và phản phân hoá.
a. Tính toàn năng của tế bào
Haberland (1902) lần ñầu tiên ñã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể
sinh vật ña bào ñều có khả năng tiềm tàng ñể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Theo
quan ñiểm của sinh học hiện ñại thì mỗi một tế bào ñã chuyên hoá ñều chứa một lượng
thông tin di truyền (bộ ADN) tương ñương với lượng thông tin di truyền của một cơ thể
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….13
trưởng thành. Vì vậy, trong ñiều kiện nhất ñịnh một tế bào bất kỳ ñều có thể phát triển
thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ðặc tính ñó của tế bào gọi là tính toàn năng của tế bào.

Như vậy, bất cứ một tế bào
nào cũng có thể hình thành một
cây hoàn chỉnh. ðó cũng là cơ
sở khoa học của kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào (in vitro) nói
chung và kỹ thuật nhân giống vô
tính (clone-nhân bản) nói riêng.
Qua ñó người ta có thể biến một
tế bào bất kỳ (hoặc một mẩu
mô) thành một cơ thể hoàn
chỉnh khi ñược nuôi cấy trong
một môi trường thích hợp có ñầy
ñủ các ñiều kiện cần thiết cho tế
bào thực hiện các quá trình phân
hóa, phản phân hoá (hình 13.1)

Hình 13.1: Sử dụng nuôi cấy các loại mô bất kỳ trên cây
b. Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào
+ Tính phân hoá của tế bào là sự biến ñổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào của
các mô chuyên hoá ñảm nhiệm các chức năng khác nhau. Trong cơ thể thực vật có khoảng
15 loại mô khác nhau ñảm nhiệm các chức năng khác nhau (mô dậu, mô dẫn, mô bì, mô
khuyết ) nhưng chúng ñều có cùng nguồn gốc từ tế bào phôi sinh ñã trải qua giai ñoạn
phân hoá tế bào ñể hình thành các mô riêng biệt.
+Tính phản phân hoá của tế bào : ñó là các tế bào khi ñã ñược phân hoá thành các mô
riêng biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong ñiều kiện nhất ñịnh chúng vẫn có thể
quay trở về trạng thái phôi sinh ñể phân chia tế bào. Ðó là tính phản phân hoá của tế bào.
Trong kỹ thuật nuôi cấy các cơ quan dinh dưỡng của cây như lá, thân, thì giai ñoạn
tạo mô sẹo (callus), ñây chính là những tế bào ñã quay trờ về trạng thái phôi sinh có khả

năng phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân
trước ñó.
Sự phân hóa và phản phân hoá giữa tế bào phôi sinh và tế bào ñã chuyên hoá ñược biểu
diễn theo sơ ñồ sau:
Phân hoá tế bào
Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá
Phản phân hóa
Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá gen. Tại một thời ñiểm
nào ñó trong quá trình phát triển cá thể thì một số gen ñược hoạt hoá và một số gen khác bị
ức chế. Ðiều này xảy ra theo một chương trình ñã ñược mã hoá trong cấu trúc phân tử
ADN. Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, nhưng
khi ñược tách rời và trong những ñiều kiện nhất ñịnh thì các gen ñược hoạt hoá dễ dàng
hơn nên chúng có khả năng mở tất cả các gen ñể hình thành một cá thể mới. Ðó chính là cơ
sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào.
5.2. Mục ñích của phương pháp nhân giống vô tính in vitro
Trong lĩnh vực nhân giống vô tính in vitro thì kỹ thuật nhân nhanh giống cây trồng
phục vụ những mục ñích sau :
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….14
– Nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác tạo giống
– Nhân nhanh và duy trì các cá thể ñầu dòng tốt ñể cung cấp cây giống của các các loại
cây trồng khác nhau như cây lương thực, cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu, cây
lâm nghiệp
– Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virút.
– Bảo quản các tập ñoàn gen, ñặc biệt ñối với loại cây dễ bị nhiễm bệnh trong ñiều kiện
tự nhiên (khoai tây, khoai lang,) hoặc các cây dễ bị giao phấn.
5.3. Ưu, nhược ñiểm của phương pháp nhân giống vô tính in vitro
Phương pháp nhân giống vô tính in vitro ñã ñược E.F. Gerge (1993) nêu lên một số ưu,
nhược ñiểm chính sau ñây:
a. Những ưu ñiểm
– Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành ñược số lượng lớn cây giống

từ một mô, cơ quan của cây với kích thước nhỏ khoảng 0,1- 10 mm. Trong khi ñó phương
pháp nhân giống truyền thống (giâm chiết cành) thì ñể tạo thành một cây giống, ít nhất
phải sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích thước từ 5-20 cm
– Hoàn toàn tiến hành trong ñiều kiện vô trùng nên cây giống tạo ñược sẽ không bị
nhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài.
– Sử dụng vật liệu sạch virút và có khả năng nhân nhanh số lượng lớn cây sạch virút.
– Hoàn toàn chủ ñộng ñiều chỉnh các tác nhân ñiều chỉnh khả năng tái sinh của cây như
thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt ñộ, chất ñiều tiết sinh trưởng theo ý muốn
– Hệ số nhân giống cao nên có khả năng sản xuất số lượng lớn cây giống trong một thời
gian ngắn. Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng từ 3
6
ñến 10
12
/ năm, như
vậy không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn
– Có thể tiến hành quanh năm mà không bị chi phối bởi ñiều kiện ngoại cảnh của thời
vụ.
– Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản ñược trong thời
gian dài trong ñiều kiện in vitro
b. Những nhược ñiểm
– Mặc dù có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra có kích thước nhỏ và ñôi khi
xuất hiện các dạng cây không mong muốn (biến dị, mọng nước).
– Cây giống in vitro do ñược cung cấp nguồn hydrat carbon nhân tạo nên khả năng tự
tổng hợp các vật liệu hữu cơ (tự dưỡng) của cây kém. Ðồng thời, cây giống in vitro ñược
nuôi dưỡng trong bình thuỷ tinh hoặc bình nhựa nên ñộ ẩm không khí thường bão hoà. Do
ñó, khi trồng cây ra ngoài ñiều kiện tự nhiên cây thường bị mất cân bằng nước, gây hiện
tượng cây bị héo và chết. Vì vậy, trước khi chuyển cây từ ñiều kiện in vitro ra ñiều kiện in
vivo, cây cần trải qua giai ñoạn “huấn luyện ” ñể quen dần với ñiều kiện môi trường bên
ngoài có ñộ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh.
– Cần trang thiết bị hiện ñại, kỹ thuật viên có tay nghề cao.

5.4. Ðiều kiện cần thiết của nuôi cấy in vitro
* Ðiều kiện trước tiên là vô trùng. Tất cả các khâu nuôi cấy ñều ñược thanh trùng: dụng
cụ nuôi cấy, mẫu nuôi cấy, môi trường (giá thể) và các thao tác nuôi cấy Sự thành công
hay thất bại của công việc nuôi cấy mô là phụ thuộc vào việc vô trùng. Nếu có một khâu
nào ñó không vô trùng thì mẫu nuôi cấy lập tức bị nhiễm vi sinh vật hoặc nấm và sẽ chết.
Khử trùng ñược thực hiện bằng các phương tiện sau:
– Nồi hấp : khử trùng bằng hơi nước có nhiệt ñộ và áp suất cao. Thường áp dụng tiệt
trùng cho môi trường nuôi cấy, dụng cụ cấy (chai, lọ, panh, dao, kéo, bông ) Với áp suất 1
atm tương ñương với 121
o
C trong khoảng thời gian từ 20 phút ñến 30 phút là ñảm bảo khử
trùng tốt.
– Tủ sấy: khử trùng bằng nhiệt ñộ cao nên chỉ áp dụng khử trùng cho các dụng cụ thuỷ
tinh và dụng cụ cấy mẫu bằng kim loại.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….15
– Phễu lọc vô trùng (Microspore): khử trùng qua phễu lọc có màng lọc kích thước nhỏ
(0,2 µm), chỉ áp dụng ñối với dung dịch trong ñiều kiện nhiệt ñộ và áp suất cao sẽ bị phân
huỷ như vitamin B
2
, gibberellin
– Hoá chất khử trùng: áp dụng ñể khử trùng bề mặt mẫu cấy hoặc ñốt dụng cụ, thường
dùng: Ca-hypocloride, Na-hypocloride, clorua thuỷ ngân (HgCl
2
), nước brôm, oxy già
(H
2
O
2
), cồn
* Phòng nuôi cấy mô là phòng thí nghiệm chuyên hoá cao với các thiết bị chuyên dụng.

Bao gồm một phòng chuẩn bị mẫu, phòng cấy mẫu, phòng nuôi cây và nhà lưới ñể ñưa cây
ra ñất. Tuỳ theo quy mô và mục ñích mà diện tích các bộ phận khác nhau. Các thiết bị
quan trọng nhất của phòng nuôi cấy mô gồm có nồi hấp ñể vô trùng dụng cụ và mẫu nuôi
cấy, máy cấy vô trùng ñể thao tác cấy mẫu, phòng nuôi có ñủ ánh sáng nhân tạo và ñiều
hoà nhiệt ñộ ñể nuôi cây
Hình 14.1 ñến hình 17.1. Trang thiết bị và phòng nuôi cấy mô tại Bộ môn Sinh lý thực
vật – khoa Nông học- ðHNNI.

a. Tủ sấy (khử trùng khô)

b. Nồi hấp (khử trùng ướt)

c. Cân phân tích, cân kỹ thuật

d. Máy ño pH

Hình 14.1 (a,b,c,d): Các thiết bị trong phòng chuẩn bị môi trường

Hình 15.1: Tủ cấy mẫu vô trùng (a.Tủ cấy ñơn ; b.Tủ cấy ñôi)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….16

Hình 16.1: Buồng nuôi cấy Hình 17.1: Vườn ươm cây
– Môi trường nuôi cấy là giá thể có ñầy ñủ chất dinh dưỡng, các hoạt chất như các
nguyên tố vi lượng, vitamin, chất ñiều hoà sinh trưởng. Tuỳ theo từng loại cây và cơ quan
nuôi cấy mà người ta ñã có các môi trường riêng cho chúng. Ví dụ: Môi trường cơ bản
nhất là môi trường MS (Murashige Skoog) cho nhiều ñối tượng cây trồng, môi trường
Adnerson cho cây thân gỗ, môi trường Gamborg cho nuôi cấy tế bào trần, môi trường
CHU cho nuôi cấy bao phấn
5.5. Thành phần môi trường dinh dưỡng
Năm 1898, Haberland ñề xướng ra tính toàn năng của tế bào và ông tiến hành những thí

nghiệm ñầu tiên về nuôi cấy mô nhưng các thí nghiệm ñều không thành công. Khi ñó do
những hiểu biết về nhu cầu dinh dưỡng khoáng của mô và tế bào thực vật còn rất hạn chế,
ñặc biệt là vai trò của các chất ñiều tiết sinh trưởng hầu như chưa ñược khám phá.
Ðến nay ñã có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng nhân tạo ñã ñược xây dựng và
thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các loại môi trường ñều bao gồm những nhóm chất chính
sau ñây:
+ Các loại muối khoáng
+ Nguồn carbon hữu cơ
+ Vitamin
+ Chất ñiều tiết sinh trưởng
+ Nhóm chất tự nhiên
+ Chất làm ñông môi trường
a. Các loại muối khoáng
Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trường dinh dưỡng cho nuôi cấy mô, tế bào thực
vật ñược phân chia thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng : nhóm nguyên tố ña lượng và
nhóm nguyên tố vi lượng.
* Các nguyên tố khoáng ña lượng
Bao gồm các nguyên tố khoáng có trong thành phần dinh dưỡng của môi trường với
nồng ñộ trên 30 ppm (part per million). Gồm những nguyên tố : N, P, K, S, Mg, Ca
– Nitơ (N) : ñược sử dụng ở dạng NO
3
–
và NH
4
+
riêng rẽ hoặc phối hợp cả hai loại
– Lưu huỳnh (S): thường sử dụng dạng SO
4
2-
. các loại SO

3
hoặc SO
2
thường kém tác
dụng, thậm trí còn ñộc.
– Phospho (P) : mô và tế bào nuôi cấy có nhu cầu về phospho rất cao. Phospho là một
trong thành phần cấu trúc phân tử axit nucleic và phân tử năng lượng ATP. Ngoài ra
phospho ở dạng H
2
PO
4
và HPO
4
còn có tác dụng như hệ thống ñệm (buffer) làm ổn ñịnh
pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy.
– Kali và can xi (K và Ca): ở dạng ion K
+
, Ca
2+
tế bào và mô dễ dàng hấp thu và ñồng
hoá
* Các nguyên tố vi lượng:
Bao gồm các nguyên tố có trong thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy với
nồng ñộ thấp hơn 30 ppm. Ðó là các nguyên tố : Fe, B, Mn, Mo, Cu, Co, Ni
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….17
– Sắt (Fe) : sắt thường tạo phức với các thành phần khác làm mất khả năng giải phóng
ion sắt cho nhu cầu của cây. Vì vậy, thường sử dụng sắt ở dạng phức chelat với citrat hoặc
với EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid). Từ phức sắt này ion Fe ñược giải phóng
trong phạm vi pH khá rộng.
Sắt quyết ñịnh khả năng phân chia của tế bào. Thí nghiệm với sắt ñánh dấu bằng ñồng

vị phóng xạ
59
Fe cho thấy sắt ñược dự trữ trong nhân tế bào rất nhiều. Thiếu sắt sẽ làm
giảm lượng ARN và giảm khả năng sinh tổng hợp protein, nhưng làm tăng lượng AND.
– Bo (B) : ñóng vai trò quan trọng trong sự hình thành nên thành tế bào và màng tế bào
thực vật. Nếu thiếu Bo sẽ ức chế sự phát sinh rễ thứ cấp và ức chế sinh trưởng chiều dài
của rễ. Bởi vì, khi thiếu Bo sẽ kích thích hoạt tính của enzym IAA oxidaza nên hàm lượng
của IAA bị giảm. Thiếu Bo thì mô nuôi cấy sẽ chuyển hoá thành mô sẹo, nhưng thường là
mô sẹo xốp, mọng nước, khả năng tái sinh chồi kém.
– Ðồng (Cu): cây hấp thu dạng ion Cu
2+
. Khoảng 50% Cu
2+
có mặt trong lục lạp. Ðồng
là thành phần của một số enzyme, là thành viên của chuỗi vận chuyển ñiện tử của hệ thống
quang hoá I và II trong quang hợp. Vì vậy, thiếu ñồng sẽ làm giảm nhanh chóng hoạt ñộng
quang hợp.
– Mangan (Mn) : thiếu Mn làm cho hàm lượng các amino axit tự do và ADN tăng lên,
nhưng lượng ARN và khả năng sinh tổng hợp protein bị giảm dẫn ñến khả năng phân bào
kém. Mangane xúc tác cho phản ứng quang phân ly nước trong quang hợp.
– Molypden (Mo) : là ion ñóng vai trò co-factor trong hệ thống nitrat reductaza, vì vậy,
Mo ñóng vai trò quan trọng trong quá trình trao ñổi ñạm trong tế bào.
– Kẽm (Zn) : là ion tham gia vào en zyme tổng hợp ARN, trong ARN-polimeraza chứa
hai ion Zn. Nồng ñộ Zn thấp sẽ làm tăng hoạt ñộng của en zyme phân giải ARN (RNAse).
Xúc tác cho phản ứng tổng hợp IAA.
– Coban (Co): có vai trò quan trọng trong quá trình có ñịnh nitơ, tổng hợp ARN và
methionine.
b. Nguồn carbon hữu cơ: mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu
theo phương thức dị dưỡng, cũng có thể sống bán dị dưỡng nhờ vào khả năng quang hợp
trong ñiều kiện ánh sáng nhân tạo, nhưng rất yếu nên không ñủ nguồn carbon hữu cơ cho

sự sinh trưởng phát triển của cây. Vì vậy, trong môi trường nuôi cấy cần ñược bổ sung
nguồn carbon hữu cơ và thường dùng saccaroza với liều lượng 2-3%. Trong một số trường
hợp ñặc biệt như nuôi cấy bao phấn lúa, nuôi cấy tế bào trần có thể dùng glucoza,
maltoza, galactoza
c. Vitamin
Mặc dù mô và tế bào nuôi cấy in vitro ñều có khả năng tự tổng hợp ñược các loại
vitamin cần thiết, nhưng thường không ñủ về lượng, do ñó phải bổ sung thêm từ bên ngoài
vào, ñặc biệt là vitamin thuộc nhóm B với nồng ñộ khoảng 1 ppm.
+ Vitamin B1 (Thiamin. HCl) : khi khử trùng môi trường bằng nồi hấp ở nhiệt ñộ và áp
suất cao thì bị phân tách thành pyrimidin và thiazol nhưng sau ñó tế bào lại có khả năng
tổng hợp chúng lại thành vitamin B1.
+ Vitamin B2 (Riboflavin): có thể khử trùng bằng nhiệt nhưng lại dễ bị ánh sáng làm
phân giải. Ðối với nuôi cấy ngoài sáng thì chỉ dùng nồng ñộ 0,01 ppm. nhưng ñối với nuôi
cấy trong tối có thể tăng lên 10-15 ppm.
+ Vitamin B6 (Pyridoxin): là tiền thân của pyridoxalphosphat – cofactor của các nhóm
enzym như carboxylaza và transaminaza. Khi hấp ở nhiệt ñộ cao xảy ra phản ứng :
pyridoxin + phosphat > pyridoxalphosphat
+ Mio Inositol : có vai trò quan trọng cho sự phân chia tế bào vì thúc ñẩy sự hình thành
thành tế bào (sinh tổng hợp polygalacturonic axit và pectin). Thường sử dụng ở nồng ñộ
cao 50-100 ppm. Trong nước dừa cũng có inositol.
+ Pantotenic axit : là thành phần của coenzym A.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….18
d. Nhóm chất tự nhiên
Các nhà sáng lập ngành nuôi cấy mô trước ñây thường sử dụng môi trường dinh dưỡng
rất ñơn giản chỉ bào gồm muối khoáng và ñường. Ngày nay người ta ñã khẳng ñịnh rằng
loại môi trường ñơn giản như vậy chưa ñủ cho tế bào sinh trưởng tốt. Vì vậy, thành phần
môi trường ngày càng phong phú, ñầy ñủ và phức tạp hơn. Người ta ñã bổ sung vào môi
trường một số nhóm chất tự nhiên nhằm làm gia tăng thành phần dinh dưỡng và cũng có cả
các chất có hoạt tính sinh lý nên kích thích sự sinh trưởng phát triển của cây in vitro.
Thường bao gồm :

+ Nước dừa: theo kết quả phân tích thành phần nước dừa của Tulecke và ctv (1961) cho
thấy trong nước dừa có nhiều nhóm chất cần thiết cho sự sinh trưởng của tế bào như :
Axit amin, axit béo, axit hữu cơ, ñường, ARN, ADN, myo inositol, các chất có hoạt tính
auxin, các glucosit của xytokinin
+ Dịch chiết nấm men: White (1934) lần ñầu tiên ñã nuôi cấy thành công rễ cây cà
chua trong môi trường có dịch chiết nấm men. Thành phần của dịch chiết nấm men gồm có
: ñường, nucleic axit, amino axit, vitamin, axin, khoáng. Tác dụng của dịch chiết nấm men
cho sự sinh trưởng của rễ rất tốt nhưng với mô sẹo thì không tốt.
+ Dịch chiết mầm lúa mì (mạch nha) : chứa chủ yếu một số ñường, vitamin và một số
chất có hoạt tính ñiều tiết sinh trưởng.
+ Dịch chiết một số loại rau, quả tươi (khoai tây, chuối, cà rốt ) thành phần có ñường,
axitnucleic, axit amin, vitamin, khoáng
e. Chất làm ñông môi trường (Agar)
Agar – là một loại polysacarit của tảo (chủ yếu tảo hồng- Rodophyta). Agar khi ngâm nước
ở 80
o
C sẽ chuyển sang dạng sol và 40
o
C thì trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước của
agar cao (6-12 g/ 1lit nước). Tuy ở trạng thái gel nhưng agar vẫn ñảm bảo cho các ion vận
chuyển dễ dàng. Vì vậy, thuận lợi cho sự hút dinh dưỡng của cây tronng nuôi cấy mô.
g. Chất ñiều tiết sinh trưởng
Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần phụ gia quan trọng nhất
quyết ñịnh ñến kết quả của nuôi cấy in vitro ñó là các chất ñiều tiết sinh trưởng. Nhóm các
nhà khoa học ở Netherandl do giáo sư F.T.M. Kors chủ biên trong cuốn “Catalo 2000-
2001″ ñã tóm tắt vai trò của các chất ñiều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô theo bảng
dưới ñây:

CHẤT ÐIỀU TIẾT SINH TRƯỞNG VAI TRÒ TRONG NUÔI CẤY MÔ
NHÓM AUXIN

Indol-3acetic axit (IAA) – Phát sinh rễ bất ñịnh (ở nồng ñộ cao)
Indol-3butyric axit (IBA) -Phát sinh chồi bất ñịnh (ở nồng ñộ thấp)
Naphthaleneacetic axit (NAA) – Tạo phôi vô tính(2,4D)
Phenylacetic axit (PAA) – Phân chia tế bào
2,4 dichlorophenoxyacetic axit (2,4D) – Phát sinh và sinh trưởng callus
2,4,5 trichlorophenoxyacetic axit (2,4,5T – ức chế bật chồi bên
P-chlorophe noxyacetic axit (CPA) – Ức chế sinh trưởng của rễ
CYTOKININ
Zeatin (Z) -Phát sinh chồi bất ñịnh (ở nồng ñộ cao)
Zeatinriboside (ZR) – ức chế sự phát sinh rễ
Isopentenyladenin (iP) – Thúc ñẩy sự phân chia tế bào
Isopentenyladenosin (iPA) – Kích thích sự bật chồi bên
6- benzylaminoburin (BAP) – Ức chế sự kéo dài của chồi
Kinetin – Ức chế sự hoá già
Thidiazuron (TDZ)
N(2-chloro-4pyridil)N
‘
phenylurea (CPPU)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….19

GIBBERELLIN
Gibberellic Axit (GA3) – Vươn dài chồi, phá ngủ của hạt, củ
Gibberellin 1 (GA1) – Phá ngủ của hạt, phôi vô tính, chồi bên
Gibberellin 4 (GA4) – ức chế phát sinh rễ bất ñịnh
Gibberellin 7 (GA7) – Kích thích sự hình thành chất ức chế
của quá trình trình tạo rễ, ra củ, rẻ hành
ABSCISIC AXIT
– Làm chín phôi vô tính

– Kích thích phát sinh chồi, củ
– Ðiều khiển sự ngủ nghỉ
ETHYLEN
– Hoá già lá
– Làm chín quả
POLYAMIN
– Thúc ñẩy sự phát sinh rễ bất ñịnh
– Thúc ñẩy sự phát sinh chồi
– Thúc ñẩy sự hình thành phôi vôi tính
JASMONIC AXIT
– Thúc ñẩy sự phát sinh củ, dẻ hành
– Làm tăng sự hình thành meristem

h. ðộ pH của môi trường.
pH của môi trường nuôi cấy thích hợp cho ña số các loại cây trồng dao ñộng từ 5,5 –
6,0. Nếu pH thấp thì agar sẽ không ñông sau khi hấp khử trùng. Khi pH <4 hoặc pH >7
thì sẽ làm kết tủ một số muối vô cơ và phân giải một số chất hữu cơ sẽ làm chết cây.
5.6. Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro
Có hai hình thức nhân giống vô tính in vitro :
+ Nhân giống vô tính bằng cách tạo cây từ chồi nách, chồi ñỉnh hoặc mô phân sinh.
Tuỳ theo từng mục ñích mà chúng ta sử dụng nguồn ñể nuôi cấy là chồi nách, chồi ñỉnh
hoặc mô phân sinh.

Hình 18.1. Nuôi cấy chồi nách, chồi ñỉnh

Hình 19.1: Mô phân sinh ñỉnh (meristem)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….20
Khái niệm mô phân sinh (meristem) chỉ ñúng khi mẫu nuôi cấy ñược tách từ ñỉnh sinh
trưởng có kích thước khoảng từ 0,1 – 0,5 mm. Khi với mục ñích nuôi cấy làm sạch virus

cho cây trồng thì bắt buộc phải nuôi cấy meristem. Tỷ lệ thành công trong kỹ thuật nuôi
cấy meristem thường không cao. Tuy nhiên, cho ñến nay người ta ñã nuôi cấy thành công
cho nhiều ñối tượng cây trồng tạo cây sạch bệnh như khoai tây, khoai lang, dứa, mía
Quy luật về sự tương quan giữa ñộ lớn của chồi nuôi cấy với tỷ lệ sống và mức ñộ ổn
ñịnh về mặt di truyền của chồi ñược biểu hiện như sau : khi kích thước chồi nuôi cấy càng
tăng thì tỷ lệ sống và tính ổn ñịnh cũng càng tăng và ngược lại kích thước chồi nuôi cấy
càng nhỏ thì tỷ lệ sống và tính ổn ñịnh cũng giảm.
Nhưng xét về hiệu quả kinh tế trong nuôi cấy mô thì: nếu kích thước của chồi nuôi cấy
tăng thì hiệu quả kinh tế giảm và ngược lại kích thước của chồi nuôi cấy giảm thì hiệu quả
kinh tế lại tăng (thể tích bình nuôi, lượng môi trường )
Khi sử dụng mẫu nuôi cấy là chồi nách hoặc chồi ñỉnh thì khả năng nuôi cấy thành công
là rất cao bởi vì ñây là hình thức phát ñộng sự sinh trưởng của chồi hoặc phá ngủ chồi nên
chồi sinh trưởng dễ dàng ñể hình thành cây. Hình thức này thường sử dụng cho các loại
cây hai lá mầm như khoai tây, cam, chanh, thuốc lá Tuy nhiên cũng có một số cây một
lá mầm như dứa quả, dứa sợi
+ Nhân giống vô tính bằng phát sinh chồi bất ñịnh (adventitiou shoots) hoặc phôi vô
tính (somatic embryos)
Chồi có thể hình thành bằng hình thức trực tiếp hoặc gián tiếp :
– Chồi phát sinh trực tiếp từ một mẩu mô hoặc cơ quan tách ra từ cây mẹ
Trên cơ thể cây, ngoài mô phân sinh và ñỉnh sinh trưởng là nguồn mẫu nuôi cấy như ñã
trình bày ở trên thì các bộ phận còn lại ñều có thể sử dụng cho việc nhân giống in vitro.
Các bộ phận ñó là :
Ðoạn thân : thuốc lá, cam, chanh
Mảnh lá : thuốc lá, cà chua, bắp cải
Các bộ phận của hoa : suplơ, lúa mỳ, ñồng tiền, phong lan
Nhánh củ, bẹ củ : hành tỏi, họ hoa huệ Liliaceae, Iridaceaee
Trong trường hợp này cần phải thực hiện quả trình phản phân hoá và tái phân hoá tế bào
ñể bắt các tế bào dinh dưỡng hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai ñoạn
phát triển mô sẹo
Ở các ñối tượng một lá mầm như lan, dưa, chuối, hoa loa kèn sự phát triển chồi

thường phải qua giai ñoạn dẻ hành (protoccorm), như vậy, mẫu cấy sẽ hình thành hàng loạt
thể protocorm, tiếp theo, các protocorm sản sinh protocorm mới hoặc phát triển thành cây
Hình 20.1.
Thể protocorm và
s
ự phát sinh chồi
từ protocorm cây
phong lan

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….21
Tuy nhiên, với
mục ñích nhân giống
vô tính, thì hình thức
tái sinh cây trực tiếp
từ mẫu nuôi cấy
không qua giai ñoạn
callus (mô s
ẹo) sẽ
rút ngắn thời gian tạo
cây ñ
ồng thời cây
ñồng nhất về mặt di
truyền.
Chồi phát sinh
gián tiếp qua giai

ñoạn mô sẹo sẽ
lâu cho cây và mô

sẹo khi cấy chuyển
nhiều lần thường
không ổn ñịnh về mặt
di truyền nên cây hay
xuất hiện dạng bất
thường
Vì vậy, ñể tránh
trường hợp ñó người
ta chỉ sử dụng mô sẹo
vừa phát sinh tức là
mô sẹo sơ cấp ñể phát

sinh cây thì giảm ñược hiện tượng biến dị.
Từ tế bào mô sẹo cũng có thể tái sinh trực tiếp thành cây hoặc có thể phải qua giai ñoạn
tạo phôi vô tính (somatic embryos) ñể thành cây.
5.7. Các bước tiến hành trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào
Cho tới nay việc sử dụng phương pháp nhân giống in vitro ñã ñược áp dụng cho nhiều
loại cây trồng (trên 400 loài). Giáo sư Murashige của trường Ðại học California ñã chia
quy trình nhân giống in vitro làm ba giai ñoạn (Murashige, 1974) và một giai ñoạn tiếp sau
in vitro:
1) Tạo vật liệu nuôi cấy khởi ñầu in vitro
2) Nhân nhanh chồi, cụm chồi in vitro
3) Tạo cây hoàn chỉnh, huấn luyện cây con
4) Chuyển cây ra trồng ngoài ñiều kiện tự nhiên
Ba giai ñoạn nhân cây in vitro ñược Edwin F. George (1993) tóm tắt trong bảng dưới
ñây :

Hình 21.1:
Nuôi cấy qua giai ñoạn callus

Hình 22.1:
Nuôi c
ấy mô phân sinh ñỉnh (meristem)
–
a,b mô
phân sinh ; c tái sinh cây; d,e cây hoàn chỉnh

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….22
Các giai ñoạn nuôi cấy in vitro

1) Tạo vật liệu nuôi
cấy khởi ñầu in vitro
2) Nhân nhanh chồi, cụm
chồi in vitro
3) Tạo cây hoàn
chỉnh, huấn luyện
cây con

Các hình thức
nhân cây in vitro
Yêu cầu : mô, cơ quan
khoẻ, sạch các vi sinh
vật

Yêu cầu: hệ số nhân chồi
hoặc phôi vô tính cao, chồi
khoẻ
Yêu cầu: cây con
hoàn chỉnh, khoẻ
mạnh, tỷ lệ sống
cao
Nuôi cấy chồi
Mẫu sử dụng là chồi
ñỉnh hoặc chồi bên ñược
cấy vào môi trường lỏng
hoặc ñặc ñể khởi ñộng
cho sự sinh trưởng chồi.
Chồi sinh trưởng ñạt
chiều cao 10 mm
Nhân nhanh chồi nách
(axilary shoots) hoặc cụm
chồi (adventitiou shoots) và
khi chồi sinh trưởng ñủ kích
thước thì tách riêng chồi ñể
nhân tiếp giai ñoạn 2 hoặc
chuyển sang giai ñoạn 3
Sinh trưởng tiếp
về chiều cao chồi

tương tự giai ñoạn
2. Ra rễ tạo cây in
vitro hoàn chỉnh

Nuôi cấy mô
phân sinh ñỉnh
(Meristem)

Mẫu sử dụng là ñỉnh
sinh trưởng với kích
thước rất nhỏ (0,1-0,5
mm) ñể nuôi cấy. Cũng
có thể sử dụng ñỉnh sinh
trưởng kích thước lớn
hơn (1-2 mm) từ những
mẫu ñã xử lý nhiệt ñộ.

Sinh trưởng chồi ñạt 10
mm, sau ñó nhân nhanh chồi
hoặc cụm chồi và chuyển
sang giai ñoạn 3

Tương tự như
phần trên
Nuôi cấy ñốt
thân
Cũng như nuôi cấy
chồi ñỉnh nhưng mẫu sử
dụng là 1 ñoạn của ñốt
thân

Nhân nhanh bằng việc gia
tăng chồi bên. Mỗi một ñốt sẽ
sinh trưởng thành chồi riêng
biệt. Cấy chuyển có thể lặp
lại nhiều lần hoặc vô hạn.
Tương tự như
phần trên
Nuôi cấy mô, cơ
quan – Tái sinh
chồi trực tiếp
Mẫu sử dụng nuôi
cấy tuỳ thuộc vào từng
loại cây : lá, thân, rễ,
hoa ñã ñược khử trùng
Tái sinh chồi trực tiếp từ
mô, cơ quan nuôi cấy mà
không qua giai ñoạn callus.
Chồi phát sinh sẽ ñược nhân
nhanh ở giai ñoạn 2 theo kiểu
nhân cụm chồi hoặc nhân
chồi ñỉnh.
Tương tự như
phần trên
Nuôi cấy mô, cơ
quan – Tái sinh
chồi gián tiếp
qua callus
Tương tự như phần trên
Phát sinh callus, tách
riêng callus ñể cấy chuyển

trong môi trường nhân
nhanh. Sau ñó chuyển sang
môi trường tái sinh chồi.
Chồi sinh trưởng ñạt chiều
cao 10 mm
Chồi ñược tách
riêng biệt và cho ra
rễ tạo cây hoàn
chỉnh
Tái sinh cây
trực tiếp từ phôi
vô tính (
somatic
e
mbryo)
Mô, cơ quan ñược
nuôi cấy tạo phôi vô
tính tuỳ thuộc từng loại
cây.
Tái sinh trực tiếp phôi vô
tính trên các mẫu nuôi cấy
mà không có callus. Nhân
nhanh phôi vô tính
Phôi vô tính
sinh trưởng hình
thành cây hoàn
chỉnh
2. Hình thức tạo
củ in vitro
(microtuber)

Mẫu nuôi cấy giống như
nhân cây in vitro, tức là
có thể dùng chồi ñỉnh,
chồi nách, vảy củ ñể
phát sinh cây in vitro
Khi cây ñạt trạng thái
dinh dưỡng nhất ñịnh thì
chuyển vào môi trường tạo
củ, ñặt trong tối hoặc ánh
sáng ngày ngắn
Sau 2-3 tháng thì
thu hoạch. Bảo
quản củ trong kho
lạnh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….23
• Giai ñoạn 1 : Tạo vật liệu khởi ñầu in vitro
Lựa chọn, ñưa mẫu vào nuôi cấy phải ñảm bảo yêu cầu :
– Tỷ lệ nhiễm thấp
– Tỷ lệ sống cao
– Tốc ñộ sinh trưởng nhanh
Kết quả giai ñoạn này phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào mục ñích khác
nhau, loại cây khác nhau ñể lấy mẫu nuôi cấy phù hợp có thể sử dụng ñỉnh sinh trưởng, chồi
nách, hoa, thân, rế, lá Khi lấy mẫu cần chọn ñúng loại mô, ñúng giai ñoạn phát triển của cây,
thường chọn mô non (ít chuyên hoá – ñỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ )
Ví dụ chọn mẫu nuôi cấy : Măng tây: chồi ngọn (Kohler, 1975)
Khoai tây: mầm (Morel, 1952)
Dứa: chồi nách, chồi ñỉnh (Paunethier, 1976)
Bắp cải: mảnh lá (Bimomilo, 1975)
Suplơ: hoa tự (Kholer, 1978)
Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi ñưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử trùng ñể

loại bỏ các vi sinh vật (nấm, khuẩn ) bám trên bề mặt mẫu cấy. Chọn ñúng phương pháp
khử trùng sẽ ñưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ ñạt ñược
tốc ñộ sinh trưởng nhanh. Thường dùng các chất: HgCl
2
0,1% xử lý trong 5-10 phút,
NaOCl hoặc Ca(OCl)
2
5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H
2
O
2
, dung dịch Br
Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến :
Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962)
Chất hữu cơ: ñường sarcaroza
Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit
Hocmon: auxin (IAA, IBA, NAA, 2,4D); Xytokinin (BA, BA, Kin, 2P); Gibberelin (GA3)
• Giai ñoạn 2 : Nhân nhanh
Mục ñích giai ñoạn này là kích thích sự phát sinh số lượng lớn chồi trên một ñơn vị mẫu
cấy trong một thời gian nhất ñịnh. Ðơn vị mẫu cấy có thể tính theo số chồi cấy ban ñầu, số
ñốt cấy ban ñầu, số protocom ban ñầu Tức là ñạt hệ số nhân giống lớn nhất.
Vật liệu khởi ñầu in vitro ñược chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung chất
ñiều tiết sinh trưởng nhóm xytokinin ñể tái sinh từ một chồi thành nhiều chồi. Hệ số nhân
phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm.
Ở giai ñoạn này cần ñảm bảo một trong các yêu cầu :
– Phát triển chồi nách
– Tạo chồi bất ñịnh (cụm chồi)
– Tạo phôi vô tính
Kết quả giai ñoạn này phụ thuộc nhiều vào việc sử dụng các tác nhân kích thích sự phân
hoá cơ quan mà ñặc biệt là phân hoá chồi như nhóm chất xytokinin và tăng cường ánh sáng

cả về thời gian và cường ñộ (16h và 2000 lux), ánh sáng tím là thành phần quan trọng ñể
kích thích phân hoá chồi (weiss và Jaffe, 1969)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….24
* Sự phát triển của chồi nách ñược kích thích bằng cách loại bỏ ưu thế ngọn khi nuôi
cấy các ñỉnh chồi và ñoạn thân mang mắt ngủ. Theo phương thức này sự phát triển chồi
diễn ra theo hai cách:
-Cắt ñoạn thân: cây phát triển trực tiếp từ chồi ñỉnh hoặc chồi nách. Thường áp dụng
cho nuôi cấy loại cây hai lá mầm như thuốc lá, khoai tây, hoa cúc
-Tách chồi: tạo cụm chồi từ chồi ñỉnh hoặc chồi nách. Thường áp dụng cho loại cây 1
lá mầm như chuối, mía, lúa, lily, ñồng tiền, layơn
– Tạo củ in vitro : củ ñược hình thành từ cây in vitro trong môi trường và ñiều kiện phù
hợp cho sự ra củ. Thường sử dụng ñối với cây nhân giống bằng củ như khoai tây, khoai
lang, cây họ hành tỏi
* Tạo chồi bất ñịnh (adventitiou shoots) : trong trường hợp này cần phải thực hiện quá
trình phản phân hoá và tái phân hoá ñể bắt các tế bào soma hình thành chồi trực tiếp hoặc
gián tiếp thông qua giai ñoạn phát triển mô seo.
Ở các ñối tượng một lá mầm như lan, dứa, chuối, hoa loa kèn thường gặp sự phát triển
cây qua giai ñoạn dẻ hành (protocorm): từ mẫu cấy tạo thành hàng loạt protocorm, từ ñó,
hoặc tiếp tục sản sinh protocorm mới hoặc phát triển thành cây.
*Tạo phôi vô tính (somatic embryos
)
: tương tự như tạo chồi bất ñịnh, ñể tạo phôi vô
tính cũng cần phải thực hiện quá trình phản phân hoá và tái phân hoá tế bào ñể tế bào
soma hình thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai ñoạn phát triển mô sẹo. Phôi
vô tính có cấu trúc lưỡng cực bao gồm cả chồi mầm và rễ mầm
Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc sử dụng làm nguyên liệu sản
xuất hạt giống nhân tạo.
* Tạo củ in vitro ( Microtuber): ñối với một số loại cây như khoai tây, khoai lang, hoa
loa kèn ngoài phương pháp nhân giống bằng cây in vitro thì người ta còn nhân giống
bằng tạo củ in vitro. Với phương pháp tạo củ in vitro, giai ñoạn ñầu mọi thao tác tương

trước như kỹ thuật nhân cây in vitro, ñến khi cây ñạt trạng thái sinh trưởng tốt thì ñược
chuyển sang môi trường ra củ, sau một thời gian khoảng từ 2-3 tháng ñể củ già sinh lý thì
thu hoạch, củ thu ñược có kích thước nhỏ nhưng hoàn toàn sạch bệnh.
• Giai ñoạn 3 : Tạo cây hoàn chỉnh và huấn luyện cây con.
Kết thúc giai ñoạn nhân cây chúng ta có ñược số lượng lớn chồi nhưng chưa hình thành
cây hoàn chỉnh vì chưa có bộ rễ cây. Vì vậy, cần chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang
môi trường tạo rễ. Tách các chồi riêng cấy chuyển vào môi trường nuôi cấy có bổ sung chất
ñiều tiết sinh trưởng nhóm auxin. Mỗi chồi khi ra rễ là thành một cây hoàn chỉnh.
Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu
xytokinin sang môi trường không chứa chất ñiều tiết sinh trưởng.
Ðối với các phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên môi trường không có chất ñiều tiết sinh trưởng
hoặc môi trường có chứa xytokinin nồng ñộ thấp thì phôi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh.
Khi ñã có cây in vitro hoàn chỉnh ñầy ñủ các cơ quan như thân, rễ, lá thì trước khi ñưa
ra ngoài ñiều kiện tự nhiên cần có giai ñoạn huấn luyện cây ñể thích nghi với những thay
ñổi về nhiệt ñộ, ẩm ñộ, sự mất nước, sâu bệnh ñể chuyển trạng thái cây từ dị dưỡng sang
tự dưỡng.
Hình từ 23.1 ñến 28.1. Minh hoạ các hình thức nhân giống vô tính cây và củ in vitro
(nguồn : bộ môn Sinh lý thực vật- ðHNNI và website www.ars.usda.gov)
+ GATrường ðại học Nông nghiệp TP.HN – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 1L ỜI NÓI ðẦUTrong quy trình tăng trưởng của mình, môn khoa học Sinh lý thực vật có hai hướngnghiên cứu chính : – Hướng nghiên cứu Sinh lý – Hoá sinh : chuyên nghiên cứu và điều tra thực chất những quy trình sốngxảy ra trong khung hình thực vật, từ ñó tìm ra những giải pháp ñiều khiển một phần hay toàn bộquá trình Sinh lý – Hoá sinh theo hướng có lợi cho con người trong ñiều kiện tự nhiên vànhân tạo như điều tra và nghiên cứu những quy trình quang hợp, cố ñịnh nitơ phân tử ( N ) và quá trìnhsinh trưởng, tăng trưởng của cây v.v … – Hướng nghiên cứu Sinh lý – Sinh thái : chuyên nghiên cứu và điều tra mối quan hệ giữa những quátrình sinh lý và những yếu tố sinh thái xanh ( nước, nhiệt ñộ, ánh sáng, O, COvà dinh dưỡng, ñất … ). Trên cơ sở ñó tìm ra ñược những quy luật hoạt ñộng của những quy trình sinh lý trongcác ñiều kiện sinh thái xanh xác ñịnh nhằm mục đích kiến thiết xây dựng mô hình sinh thái tối ưu cho những quá trìnhsinh lý giúp cây sinh trưởng, tăng trưởng và cho hiệu suất cao, chất lượng tốt. Sinh lý học thực vật còn ñược chia ra những chuyên khoa : – Sinh lý thực vật ñại cương – Chuyên điều tra và nghiên cứu những công dụng sinh lý chung củathực vật. – Sinh lý thực vật chuyên khoa – Nghiên cứu những quy luật sinh lý cho từng nhómcây, từng cây như Sinh lý cây xanh, Sinh lý cây rừng, Sinh lý cây ăn quả, Sinh lý cây lúa, cây ñậu tương, Sinh lý cây ngô, cây khoai tây v.v … – Sinh lý thực vật ứng dụng. + Cơ sở biên soạn giáo trìnhNhững năm gần ñây, Sinh lý học thực vật ngày càng tiếp cận với trách nhiệm của thực tiễnsản xuất nông nghiệp, lâm nghiệp, dữ gìn và bảo vệ và chế biến nông sản v.v … và nó có vai trò rấtquan trọng cho những ngành sản xuất này. Do khuôn khổ giáo trình Sinh lý thực vật cơ bản cóthời lượng số lượng giới hạn, không hề trình diễn hết ñược những ứng dụng và năng lực ứng dụngcủa môn khoa học này vào sản xuất, trong khi những vấn ñề ứng dụng vào thực tiễn sảnxuất người kỹ sư nông học rất cần ñược trang bị. Trước toàn cảnh ñó môn học Sinh lý thựcvật ứng dụng ra ñời. + ðối tượng và trách nhiệm của môn học Sinh lý thực vật ứng dụng. Hiểu rõ nguyên tắc và ứng dụng vào ñối tượng cây xanh. Vì vậy, trách nhiệm chính củaSinh lý thực vật ứng dụng là điều tra và nghiên cứu, ứng dụng những quy luật sinh lý của cây cối ñãbiết vào thực tiễn sản xuất như : • Các kiến thức và kỹ năng về Sinh lý tế bào ñã và ñang ñược ứng dụng thoáng đãng, hiệu suất cao trongcông nghệ nhân giống vô tính cây xanh bằng con ñường nuôi cấy mô ( in vitro ), giâm chiết cành ( in vivo ) ñể cung ứng cho sản xuất cây giống có chất lượng cao. • Các kiến thức và kỹ năng về trao ñổi nước và dinh dưỡng khoáng ñược ứng dụng vào việcchuẩn ñoán nhu yếu nước, dinh dưỡng ñối với cây. Từ ñó có những giải pháp tướinước, bón phân hài hòa và hợp lý cũng như ứng dụng trong công nghệ tiên tiến trồng cây không dùngñất, góp thêm phần tạo nên một nền nông nghiệp sạch và vững chắc. • Các kiến thức và kỹ năng về quang hợp giúp tất cả chúng ta ñưa ra những giải pháp kỹ thuật ñiều khiểnhệ quang hợp trong quần thể cây cối ñể “ kinh doanh thương mại ” nguồn năng lượng ánh sáng mặttrời hiệu suất cao nhất. • Những kiến thức và kỹ năng về hô hấp ñưa ñến những giải pháp kỹ thuật dữ gìn và bảo vệ nông sảnphẩm và ngâm ủ hạt giống, làm ñất gieo hạt • Sự hiểu biết về sinh trưởng, tăng trưởng của thực vật cũng như những chất ñiều hoà sinhtrưởng thực vật ñã và ñang ñược ứng dụng thoáng đãng trong nông nghiệp ñể ñiềukhiển cây sinh trưởng, tăng trưởng theo hướng có lợi cho con người. Trường ðại học Nông nghiệp TP. Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 2N goài ra những kiến thức và kỹ năng hiểu biết về Sinh lý học thực vật còn ñược ứng dụng trongñiều khiển và khai thác những hệ sinh thái tối ưu, tương quan ñến việc bảo vệ môi trường tự nhiên bềnvững. + Kết cấu của giáo trình sinh lý thực vật ứng dụng : gồm 7 chươngChương I : Nhân giống vô tính cây xanh. Chương II : ðiều khiển trao ñổi nước và dinh dưỡng khoáng ñối với cây cối. Chương III : Trồng cây không dùng ñất. Chương IV : Quang hợp của quần thể cây xanh. Chương V : ðiều khiển hô hấp trong trồng trọt và dữ gìn và bảo vệ nông sản phẩm. Chương VI : Ứng dụng chất ñiều hoà sinh trưởng trong trồng trọt. Chương VII : ðiều chỉnh phát sinh hình thái của cây. Trong quy trình biên soạn giáo trình này chúng tôi ñã phối hợp những kiến thức và kỹ năng của Sinhlý học thực vật với sự hiểu biết về những ứng dụng và năng lực ứng dụng của môn học nàytrong sản xuất. Do ñó cuốn giáo trình này không chỉ là tài liệu học tập thiết yếu cho sinhviên ngành nông học mà còn là tài liệu tìm hiểu thêm cho tổng thể những ai chăm sóc ñến lĩnhvực này. Tuy nhiên, vì ñây là giáo trình biên soạn lần ñầu và thời hạn hạn chế, lượng thông tin cóthể còn hạn chế nên trong biên soạn không tránh khỏi những khiếm khuyết. Chúng tôi rấtmong nhận ñược sự góp ý của những chuyên viên và bạn ñọc ñể cuốn sách này ñược hoànthiện hơn. ðể học tốt hơn môn học này, nên tìm hiểu thêm thêm một số ít tài liệu sau : 1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội. Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiếngiống cây xanh. NXB nông nghiệp, Thành Phố Hà Nội, 1997.2. Trần Minh Tâm. Bảo quản và chế biến nông sản sau thu hoạch. NXB Nông nghiệp, Thành Phố Hà Nội, 2002.3. Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn. Chất ñiều hoà sinh trưởng với cây xanh. NXB Nông nghiệp, TP. Hà Nội, 1993.4. Vũ Văn Vụ. Sinh lý thực vật ứng dụng. NXB Giáo dục đào tạo, Thành Phố Hà Nội, 1999. Các tác giả. Trường ðại học Nông nghiệp Thành Phố Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 3A. PHẦN LÝ THUYẾTCHƯƠNG INHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TRỒNG – Nắm ñược những khái niệm và những ưu nhược ñiểm của những hình thức nhân giống thựcvật nói chung và nhân giống cây cối nói riêng. Dựa vào năng lực nhân giống vô tínhthực vật trong tự nhiên ñể con người vận dụng vào thực tiễn sản xuất trong công tác làm việc nhângiống vô tính cây cối. Nắm ñược cơ sở khoa học và những ưu nhược ñiểm của cácphương pháp nhân giống vô tính cây xanh tự tạo – Kỹ thuật nhân giống vô tính cây xanh in vivo ( chiêu thức giâm, chiết cành ; ghépcành ) : những ưu nhược ñiểm, cơ sở khoa học của chiêu thức, những thao tác đơn cử. Ứngdụng của từng giải pháp trong sản xuất. – Kỹ thuật nhân giống vô tính cây xanh in vitro ( phương pháp nhân giống vô tính bằngnuôi cấy mô tế bào ) : cơ sở khoa học, ưu nhược ñiểm, những ñiều kiện thiết yếu trong kỹ thuậtnuôi cấy mô tế bào, kỹ thuật của từng giai ñoạn nuôi cấy mô tế bào. Ứng dụng vào thựctiễn sản xuất1. Một số khái niệm tương quan ñến nhân giống * Sinh sản ( Reproduction ) : là năng lực sinh vật tái tạo những thế hệ. Phương thức sinh sản rấtña dạng nhưng ñều thuộc hai hình thức chính là sinh sản hữu tính và sinh sản vô tính. Sinh sản hữu tính ( Secxual reproduction ) là hình thức sinh sản có sự tích hợp của giaotử ñực và cái ñể tạo thành phôi, sau ñó tăng trưởng thành khung hình mới hoàn hảo. Sinh sảnhữu tính hoàn toàn có thể là tự phối hoặc tạp giao. Sinh sản vô tính ( Asecxual reproduction ) là hình thức sinh sản không có sự kết hợpcủa giao tử ñực và cái. Sinh sản vô tính ở cây cối có những hình thức sau : Sinh sản vô phối ( Agamic reproduction ) : phôi ñược tạo ra không do thụ tinh giữa tếbào trứng và tinh trùng, ñây là hiện tượng kỳ lạ tự nhiên ñể tạo ra dòng vô tính trải qua hạtgiống. Sinh sản sinh dưỡng ( Vegetative reproduction ) : là năng lực tái tạo một khung hình mớihoàn chỉnh từ một bộ phận nào ñó ñược tách rời khỏi khung hình mẹ như thân, rễ, lá, củ, chồiTrong tự nhiên, nhiều loại cây xanh hoàn toàn có thể sinh sản vừa bằng hình thức hữu tính, vừabằng hình thức vô tính, nhưng cũng có nhiều loại cây cối chỉ sinh sản bằng hình thứchữu tính hoặc vô tính * Nhân giống ( Propagation ) : là giải pháp kỹ thuật mà con người dùng ñể tái tạo những cáthể thiết yếu trải qua mạng lưới hệ thống sinh sản. Vì vậy, hoàn toàn có thể sử dụng hình thức nhân giốngbằng chiêu thức hữu tính hoặc giải pháp vô tính tuỳ vào mục ñích cũng như những loạicây trồng. 2. Nhân giống cây cối bằng giải pháp hữu tính + Khái niệm : nhân giống bằng chiêu thức hữu tính là hình thức cây con ñược hìnhthành từ hạt. Ðây là hình thức nhân giống truyền thống mà con người sử dụng từ khi biết trồngtrọt. Hạt là ñược hình thành do hiệu quả thụ tinh giữa giao tử ñực ( hạt phấn ) với giao tử cái ( noãn ). Từ hạt sẽ hình thành một cây mới mang ñặc tính của cả cây bố và cây mẹ ( trongtrường hợp thụ phấn chéo ) hoặc nghiêng hẳn về cây bố hoặc cây mẹ ( trong trường hợp vôphối ). Hạt ñược hình thành do quá trình tự thụ phấn của hoa hoặc do thụ phấn tự tạo. + Những ưu ñiểmƯu ñiểm của phương pháp nhân giống hữu tính ñã ñược Edwin. F. George ( 1993 ) tổngkết thành bốn ñiểm chính sau : – Phương pháp thực thi ñơn giản trong tự nhiên hoặc tự tạo mà không cần sử dụngdụng cụ thiết bị phức tạp. Ðồng thời, phương pháp nhân giống hữu tính tạo nên ñược mộtsố lượng lớn cây giống nên giá tiền cây giống thường rẻ. Trường ðại học Nông nghiệp TP.HN – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 4 – Hạt giống hoàn toàn có thể dữ gìn và bảo vệ ñược trong thời hạn dài trong những dụng cụ ñơn giản nhưbao bì, chum, vại, chai, lọ tuỳ thuộc từng loại hạt và sự rủi ro đáng tiếc trong quy trình bảo quảnthấp, hạt giống ñảm bảo tỷ suất sống cao. – Dễ dàng luân chuyển và phân phối khối lượng lớn hạt giống từ nơi sản xuất ñến nơitiêu thụ. – Các loại sâu bệnh và virut phần đông là không lây truyền qua hạt nên cây giống mọc từhạt là cây sạch bệnh. + Những nhược ñiểmNhược ñiểm lớn nhất của phương pháp nhân giống hữu tính là ña số cây con ñược sinhra từ hạt sẽ có những tính trạng thay ñổi so với cây mẹ, mỗi một sự thay ñổi ñó là ñại diệncủa một tổng hợp gen mới ñược hình thành trong quy trình phân bào giảm nhiễm. Vì vậy câynhân giống bằng giải pháp hữu tính thường không ñồng ñều và không trọn vẹn mangcác tính trạng như cây mẹ. Ðối với loại cây ăn quả, cây công nghiệp dài ngày thì nhân giống bằng phương pháphữu tính ngày càng giảm, người ta chỉ vận dụng hình thức này trong những trường hợp khóthành công trong phương pháp nhân giống vô tính, những loại cây có hạt ña phôi, sử dụng chocông tác lai tạo và tinh lọc giống. 3. Nhân giống cây xanh bằng giải pháp vô tínhKhái niệm : nhân giống vô tính cây cối là giải pháp tạo cây con từ những cơ quan, bộphận dinh dưỡng của cây như cành, thân, rễ, lá, củ Ðây là hình thức nhân giống thông dụng ởnhiều loại cây xanh. Quá trình nhân giống vô tính hoàn toàn có thể diễn ra trong tự nhiên và tự tạo. 3.1 Nhân giống vô tính tự nhiênLà hình thức nhân giống mà con người tận dụng năng lực sinh sản dinh dưỡng của câytrồng, tận dụng năng lực phân loại những cơ quan dinh dưỡng của cây xanh ñể hình thànhmột thành viên mới có năng lực sống ñộc lập với cây mẹ và mang những tính trạng của cây mẹ. Hình thức này gồm có : * Dùng thân bò lan : Ở phần mắt giữa hai lóng, nếu ñược tiếp xúcvới ñất sẽ mọc rễ, phía trên mọc chồi ñể tạo thànhmột cây con hoàn hảo, tách rời khỏi khung hình mẹñem trồng thành một cây mới. Biện pháp này thường vận dụng ñối với một sốloại cây có tia thân như cây dâu tây. Biện pháp nàyrất ñơn giản vì loại cây này khi tia thân bò ñến ñâuthì mỗi ñốt sẽ hình thành một cây mới, ta chỉ việctách những cây mới ñem trồng ( hình 1.1 ). Hình 1.1 : Thân bò lan * Tách chồi : Chồi ñược hình thành từ gốc thân chính có ñầy ñủ thân, lá, rễ. Tuỳ từngloại cây cối mà có những loại chồi khác nhau như chồi thân ( chuối ), chồi ngầm ( khoainước, sen ), chồi cuống quả, chồi chóp quả ( dứa ). Các chồi nay sau khi tách khỏi khung hình mẹcó thể ñem trồng ngay hoặc qua giai ñoạn vườn ươm. * Nhân giống bằng thân củ, thân rễ ( thân sinh ñịa ) : Trên thân của loại cây sinh ñịacó mang những chồi hoặc nhiều mắt chồi, mỗi mắt hoàn toàn có thể tăng trưởng thành chồi và thành câyhoàn chỉnh, do vậy hoàn toàn có thể dùng cây sinh ñịa ñể nhân giống như hành, khoai tây, gừng, hoàng tinh3. 2. Nhân giống vố tính nhân tạoLà hình thức nhân giống vô tính có sự tác ñộng của những giải pháp cơ học, hoá học, côngnghệ sinh học ñể ñiều khiển sự phát sinh những cơ quan bộ phận của cây như rễ, chồi, láhình thành một cây hoàn hảo trọn vẹn có năng lực sống ñộc lập với cây mẹ. Cây ñượctạo nên từ phương pháp nhân giống này mang trọn vẹn ñặc tính di truyền như cây mẹ. Trường ðại học Nông nghiệp Thành Phố Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 5N gười ta phân loại làm hai loại : – Nhân giống vô tính ñược triển khai trong ñiều kiện tự nhiên ( in vivo ), với hình thứcnày, cây giống tạo ra có kích cỡ lớn ( Macro propagation ) – Nhân giống vô tính ñược triển khai trong phòng thí nghiệm ( in vitro ), với hình thứcnày cây giống có kích cỡ nhỏ ( Micro propagation ). 4. Nhân giống vô tính in vivo ( Macro propagation ) Nhân giống vô tính in vivo tức là quy trình nhân giống ñược triển khai trong ñiều kiệntự nhiên gồm những hình thức như tách cây, giâm cành, chiết cành, ghép mắt ñể tạo cây concó ñặc tính giống hệt cây mẹ. * Cơ sở khoa họcTất cả những loại thực vật ñều có ñặc tính tái sinh, tức là, khi tách rời một cơ quan bộphận nào ñó của cây ra khỏi cây mẹ thì lúc ñó trạng thái nguyên vẹn của cây bị vi phạm, nhờ có ñặc tính tái sinh mà cây có năng lực Phục hồi lại trạng thái nguyên vẹn của mình. Ðặc tính tái sinh ở thực vật lớn hơn ñộng vật rất nhiều. Vận dụng ñặc tính tái sinh của thựcvật mà con người ñiều khiển cây cối theo hướng có lợi như giải pháp cắt tỉa tạo tán chocây cảnh, cây lấy búp ; nhân giống vô tính cây xanh Trong biện pháp nhân giống vô tínhcây trồng thì năng lực ra rễ bất ñịnh của cành chiết, cành giâm hoặc liền vết ghép ñều dựavào ñặc tính tái sinh ñể ñảm bảo tính nguyên vẹn của cây. Khi tách một cành ra khỏi cây mẹ thì cây ñó ñã bị mất tính nguyên vẹn của mình, ñểkhôi phục lại tính nguyên vẹn của mình, cây có năng lực sinh ra một chồi mới ñể bù ñắpcành vừa mất ñi. Ðồng thời cành ñược tách ra khỏi cây mẹ lúc ñó cũng bị mất tính nguyênvẹn của một cây, tức là, cành bị thiếu phần rễ ñể trở thành cây hoàn hảo, nên nó sẽ tựkhôi phục tính nguyên vẹn của mình bằng năng lực hình thành rễ bất ñịnh ñể trở thành câyhoàn chỉnh. Hoặc khi ghép mắt thì nhờ năng lực tái sinh của những tế bào xung quanh phầnbị cắt ñã làm liền vết thương và đảm nhiệm mắt ghép. * Ưu ñiểm của phương pháp nhân giống vô tính in vivoNhân giống vô tính in vivo bằng những giải pháp giâm cành, chiết cành và ghép mắt cómột số ưu ñiểm chính sau : – Tỷ lệ thành công xuất sắc trong nhân giống cao. Các giải pháp giâm, chiết cành hoặc ghép mắttỷ lệ tạo cây giống thường ñạt ñược từ 50 % ñến 100 % tuỳ theo từng ñối tượng cây xanh vàcác giải pháp vận dụng. Hiện nay, người ta thường sử dụng những chất ñiều tiết sinh trưởng ñểkhích thích sự ra rễ bất ñịnh cho cành chiết cành giâm thì tỷ suất ra rễ ñạt tới 100 %. – Thời gian tạo cây giống nhanh. Thông thường thời hạn tạo cây giống trong kỹ thuậtgiâm, chiết cành hoặc ghép mắt chỉ từ vài ngày ñến vài tháng tuỳ theo từng ñối tượng câytrồng và giải pháp vận dụng. Bộ môn Sinh lý thực vật – Trường ñại học Nông Nghiệp I rấtthành công trong kỹ thuật giâm cành của nhiều loại ñối tượng cây cối như cây khoai tây, cẩm chướng, cây roi, bưởi, chanh chỉ sau từ 3 ñến 7 ngày thì cành giâm ra rễ bất ñịnh vàsau khoảng chừng 1 – 4 tuần thì cây giống ñủ tiêu chuẩn xuất vườn. – Tạo cây giống có size lớn. Cây giống ñược tạo bằng giải pháp giâm, chiết cànhhoặc ghép mắt có size lớn hơn nhiều so với phương pháp nhân giống in vitro. Kíchthước của cây giống khoảng chừng từ một ñốt ñến nhiều ñốt cây tuỳ thuộc vào ñối tượng câytrồng và nhu yếu của thông số nhân giống. – Cây giống mang ñặc tính của cây mẹ. Biện pháp giâm chiết cành và ghép mắt cũngnhư những biện pháp nhân giống vô tính nói chung, cây giống tạo thành từ những cơ quan dinhdưỡng của cây mẹ nên có tuổi sinh học của cây mẹ và mang ñặc tính di truyền của cây mẹ. – Thao tác và trang thiết bị ñơn giản. Kỹ thuật nhân giống vô tính bằng giải pháp giâm, chiết cành hoặc ghép mắt rất thuận tiện vận dụng cho mọi ñối tượng lao ñộng trong nghề làmvườn. Mọi thao tác trong quy trình tiến độ giâm chiết cành hoặc ghép mắt rất ñơn giản và hoàntoàn không nhu yếu những thiết bị hiện ñại. Trường ðại học Nông nghiệp TP.HN – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 64.1. Nhân giống vô tính bằng tách câyMỗi cây thường chỉ có một gốc và một bộ rễ, tuy nhiên, con người hoàn toàn có thể sử dụng cácbiện pháp kỹ thuật tác ñộng ñể cây phát sinh nhiều gốc, mỗi gốc có bộ rễ riêng không liên quan gì đến nhau, rồitách riêng từng gốc ñem trồng thành cây mới. Ví dụ giải pháp cưa gốc cho nảy chồi rồivun ñất vào gốc cho ra rễ, tách ra trồng. Phương pháp này chậm, hiệu suất cao thấp, tốn côngnên ít ñược vận dụng. 4.2. Nhân giống vô tính bằng giâm, chiết cànhPhương pháp giâm, chiết cành dựa trên năng lực hình thành rễ bất ñịnh của cành giâmhoặc chiết khi ñược cắt rời khỏi cây mẹ. Phương pháp này thường ñược vận dụng cho cả hainhóm cây thân gỗ và thân thảo như cây vải, nhãn, cam, chanh, khoai tây, mía, dứa, hoacúc, cẩm chướng * Cơ sở khoa học của sự hình thành rễ bất ñịnhKhi có tác ñộng vào cây mẹ như cắt cành giâm ra khỏi khung hình cây mẹ hoặc khoanh vỏcành chiết thì lúc ñó trong khung hình cây mẹ sẽ bắt ñầu hoạt hoá sự hình thành rễ bất ñịnh. Yếutố gây hoạt hoá sự hình rễ bất ñịnh là auxin. Khi có tác ñộng cắt cành hoặc khoanh vỏ thì auxin sẽ ñược hình thành một cách nhanhchóng tại ñỉnh sinh trưởng và những cơ quan non, sau ñó qua mạng lưới hệ thống mạch libe auxin ñượcvận chuyển về phần vết cắt của cành chiết, cành giâm ñể kích thích tạo rễ bất ñịnh. Vì vậy, sự ra rễ bất ñịnh của cành chiết, cành giâm nhanh hay chậm là trọn vẹn nhờ vào vàokhả năng tổng hợp auxin nội sinh của từng loại cây xanh. Người ta hoàn toàn có thể giải quyết và xử lý bổ sungauxin ngoại sinh ñể thúc ñẩy nhanh gọn sự ra rễ bất ñịnh của cành chiết, cành giâm. Sự hình thành rễ bất ñịnh là một quy trình, ñó là quy trình phản phân hoá của tế bàotiền tượng tầng, tiếp ñó là tái phân hoá ñể hình thành mầm rễ ( hình 2.1 ) Quá trình hình thành rễ bất ñịnh chia làm ba giai ñoạn : – Phản phân hoá của tế bào tiền tượng tầng ñể trở lại tính năng phân loại tế bào củamô phân sinh tượng tầng ñể tạo khối tế bào bất ñịnh ( callus ) – Tái phân hoá tế bào rễ từ những tế bào bất ñịnh ñể hình thành mầm rễ bất ñịnh – Mầm rễ sinh trưởng ñể hình thành rễ bất ñịnh. Thông thường, giai ñoạn ñầu của sự hình thành rễ bất ñịnh cần lượng auxin lớn nhấtcho sự phản phân hoá tế bào ( 10-4 – 10-5 g / cm ), giai ñoạn thứ hai cần lượng auxin thấp hơncho sự tái phân hoá mầm rễ ( 10-7 g / cm ), còn giai ñoạn sinh trưởng rễ lượng auxin cần rấtthấp ( 10-11 – 10-12 g / cm ) hoặc không cần auxin trong giai ñoạn này. a bHình 2.1 : Sự phản phân hoá tế bào tượng tầng ñể hình thành rễ bất ñịnha, b. Lát cắt dọc và cắt ngang mầm rễ bất ñịnhTrường ðại học Nông nghiệp TP.HN – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 7T rong kỹ thuật giâm, chiết cành, người ta thường giải quyết và xử lý bổ trợ những chất thuộc nhómauxin ngoại sinh ñể kích thích sự tạo rễ bất ñịnh nhanh và hiệu suất cao hơn như IBA, α-NAA, 2,4 D Tuỳ theo chất sử dụng và loại cây cối, cũng như tuỳ theo giải pháp giải quyết và xử lý mà nồng ñộsử dụng là khác nhau. Có ba phương pháp chính ñể giải quyết và xử lý auxin cho sự ra rễ bất ñịnh : – Phương pháp giải quyết và xử lý nồng ñộ loãng : nồng ñộ giải quyết và xử lý vào khoảng chừng vài chục ppm. Với phương pháp giâm cành thì ngâm phần gốc vào dung dịch trong thời hạn 12 ñến24 giờ rồi cắm cành giâm vào giá thể. Với phương pháp chiết cành thì trộn dung dịch giải quyết và xử lý với ñất bó bầu trước khi bó bầuxung quanh vết khoanh vỏ. – Phương pháp giải quyết và xử lý nồng ñộ ñặc : nồng ñộ giải quyết và xử lý khoảng chừng vài nghìn ppm. Với phương pháp giâm cành thì nhúng rất nhanh phần gốc vào dung dịch trong khoảng1-2 giây rồi cắm ngay vào giá thểVới phương pháp chiết cành thì dùng bông tẩm dung dịch giải quyết và xử lý và chỉ cần bôi lên trênvết khoanh vỏ trên ( nơi sẽ Open rễ ) trước khi bó bầu – Sử dụng dạng bột : có nhiều chế phẩm giâm chiết cành dạng bột, trong thành phần cóchứa auxin với một tỷ suất nhất ñịnh ñược phối trộn với một loại bột nào ñó. Khi giâm cànhchỉ cần chấm vết cắt của cành giâm vào chế phẩm bột rồi cắm vào giá thể. a. Nhân giống vô tính bằng chiết cành * Ưu ñiểm : – Cây con dễ sống, sinh trưởng nhanh, mọc khoẻ – Cây con mang ñầy ñủ ñặc tính di truyền của cây mẹ – Cây thấp, tán gọn nên thuận tiện cho chăm nom và thu hoạch * Nhược ñiểm : – Hệ số nhân giống không cao, chỉ sử dụng trong sản xuất nhỏ – Cây nhanh già cỗi, tuổi thọ vườn cây thấp, năng lực chống chịu với ñiều kiện bất lợicủa thiên nhiên và môi trường không cao – Cây mẹ bị khai thác nhiều sẽ làm giảm tuổi thọ và sức sống * Các hình thức chiết cành + Chiết cành bằng giải pháp uốn vít cànhBiện pháp uốn cành thường vận dụng choñối tượng cây thân bụi, thân thảo như câyñỗ quyên, kim ngân, ráy thơmCách thực thi : uốn vít cành xuống rồiphủ ñất lên, sau một thời hạn phần ñượcphủ ñất sẽ ra rễ ( hình 3.1 ). Ðể kích thích rarễ nhanh hoàn toàn có thể gây vết thương nhẹ lêncành uốn tại phần phủ ñất. Cắt rời từngphần ñã ra rễ ñể tạo cây giống mới. Hình 3.1 : Biện pháp uốn vít cành + Chiết cành trên câyÐây là giải pháp vận dụng thông dụng cho nhóm cây thân gỗ như loại cây ăn quả nhãn, vảihồng xiêm, chanh, roi, cam, quýt, bưởi ; nhóm cây công nghiệp như chè, cafe ; nhómcây rừng như bạch ñàn, quế, hương cành vẫn ở trên cây từ khi ñược chiết ñến khi ra rễbất ñịnh tạo cây hoàn hảo mới cắt xuống ñem trồng. Theo học thuyết chu kỳ luân hồi tuổi của Trailakhyan thì mỗi cành ở trên cây có tuổi sinh họckhác nhau. Nếu cành có tuổi sinh học trung bình sẽ có năng lực tạo rễ bất ñịnh tốt hơnnhững cành có tuổi sinh học quá lớn hoặc quá nhỏ. Vì vậy, với mục ñích nhân giống vôtính bằng kỹ thuật chiết cành người ta thường lựa chọn những cành trên cây có tuổi sinhhọc trung bình hay còn gọi là cành bánh tẻ ñể chiết. Trường ðại học Nông nghiệp TP.HN – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 8C ách triển khai : dùng dao sắc cắt hai khoanh vỏ cách nhau khoảng chừng 2-3 cm ( hình 4.1. a, b ) sau ñó vô hiệu lớp vỏ ngoài, dùng dao sắc cạo sạch lớp vỏ trắng tiếp theo ñến tận phầngỗ ( hình 4.1. c ). Hình 4.1 : Cách khoanh vỏ cành chiếta, b. khoanh vỏ c. Bóc và cạo sạch lớp vỏThường ñể phơi cành khoảng chừng một buổihoặc một ngày sau mới bó bầu. Ðối với những cây khó ra rễ như cây hồngxiêm, mận, mơ, mít trước khi bó bầu ta nênxử lý cho vết khoanh vỏ ( vết khoanh trên ) dung dich auxin ( α-NAA ) 4000 – 8000 ppmhoặc trộn dung dich auxin vào hỗn hợp bó bầuvới nồng ñộ thấp hơn ( 40 – 100 ppm ). Nguyên liệu dùng ñể bó bầu thường sửdụng là hỗn hợp giữa ñất vườn hoặc ñất bùn aophơi khô, ñập nhỏ trộn với một trong sốnguyên liệu hữu cơ như trấu bổi, mùn cưa, rơmrác mục, rễ bèo tây với tỷ suất 2/3 ñất với 1/3 nguyên vật liệu hữu cơ. Ðảm bảo 70 % ñộ ẩm của hỗn hợp bó bầu. Phía ngoài của bầu chiết bọc bằng giấy PEtrong. Buộc chặt hai ñầu bầu chiết vào cành ñểbầu không bị xoay xung quanh cành chiết ( hình 5.1 ). Hình 5.1 : Cách bó bầu cành chiếta bHình 6.1 : Sự ra rễ bất ñịnh của cành chiết ñủ tiêu chuẩn cắta. Ra rễ bất ñịnh b. Cắt cành chiếtSau ñó theo dõi qua lớp PE khi thấy rễ ñã mọc ra phía ngoài bầu và chuyển màu trắngnõn sang màu trắng ngà hoặc hơi ngả màu xanh thì hoàn toàn có thể cưa cành chiết ñể trồng vàovườn ươm ( hình 6.1. a, b ) b. Nhân giống vô tính bằng giâm cành * Ưu ñiểm : – Cây con giữ ñựơc những thực trạng di truyền của cây mẹ, vườn cây ñồng ñều thuận tiệnchăm sóc, thu hoạch – Thời gian nhân giống tương ñối nhanh, thông số nhân giống cao – Chu kỳ khai thác ngắn, hiệu suất cao kinh tế tài chính caoọc giấyPE trongỗn hợp bóbầu chiếtGiây buộcTrường ðại học Nông nghiệp TP.HN – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 9 * Nhược ñiểm : – Tuổi thọ vườn cây thấp, chu kỳ luân hồi kinh doanh thương mại ngắn – Ðòi hỏi người sản xuất có trình ñộ kỹ thuật nhất ñịnh – Tốn nhiều công chăm nom * Các hình thức giâm cànhTuỳ theo từng ñối tượng cây cối và mục ñích nhân giống mà người ta vận dụng cáchình thức giâm cành khác nhau. Sau ñây là 1 số ít giải pháp giâm cành phổ cập cho cácñối tượng cây cối : + Giâm cành bằng giải pháp cắt cành hoặc cắt thân. Ðây là giải pháp vận dụng thông dụng cho nhiều ñối tượng cây cối, những loại cây thân gỗnhư cây nhãn, vải, cam, chanh, bưởi, cafe, chè ; những loại cây rau, cây hoa thân thảo nhưkhoai tây, hoa cúc Một số cây hoàn toàn có thể thực thi nhân giống bằng chiêu thức cắt cànhhoặc cắt thân quanh năm. Trong khi ñó 1 số ít cây ñặc biệt là một số ít cây thân gỗ chỉ có thểthực hiện vào mùa rụng lá khi mà cây ñang ở trạng thái ngủ nghỉ. Cách thực thi : dùng dao sắc cắt vát ở vị trí phía dưới của ñốt cành hoặc ñốt thân vớikích thước tuỳ thuộc vào từng ñối tượng cây xanh và mục ñích nhân giống. Có thể cắttừng ñốt ñơn hoặc ñốt kép ( ñối với cây có lá ñối xứng ) ( hình 7.1. a, b, c, d ). Loại bỏ bớt mộtphần của lá nếu lá quá to. Nhúng nhanh auxin ( α-NAA vài nghìn ppm ) vào vết cắt nếu cầnthiết, sau ñó cắm vào giá thể giâm cành với chiều sâu khoảng chừng 1 cm hoặc ñặt nằm ngang lấp1 / 2 thân vào giá thể ( ñối với cây mía, ñay, mây ). Ðảm bảo ñộ ẩm thích hợp của giá thểvà ñộ ẩm bão hoà trên mặt phẳng lá ñến khi Open rễ bất ñịnh của cành giâm. Chăm sóccẩn thận ñến khi xuất vườn. ( a ) ( b ) ( c ) ( d ) Hình 7.1 : Giâm cành bằng những giải pháp cắt cành, cắt thâna. Cắt cành ; b. Cắt thân nằm ngang ; c. Cắt ñốt ñơn ; d. Cắt ñốt képTrường ðại học Nông nghiệp TP. Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 10H ình 8.1 : Giâm cành bằng giải pháp cắt láa. Giâm lá nguyên vẹn b. Giâm mẩu lá + Giâm cành bằng giải pháp cắt láBiện pháp này ñược vận dụng ñối với những loại hoa lá cây cảnh, cây xanh chậu trong nhà, ñặcbiệt thường sử dụng ñối với cây lá bỏng. Có hai loại kiểu cắt lá : cắt hàng loạt lá và cắt mẩulá ( hình 8.1. a, b ). Khi lá ñược cắt rời khỏi cây mẹ thì rễ bất ñịnh sẽ ñược hình thành tạiphần cuống lá hoặc trực tiếp trên lá. Cách thực thi : Biện pháp này mọi thao tác và tiến trình thực thi cũng tựa như nhưbiện pháp cắt cành ñã nêu ở trên nhưng chỉ dùng phần lá cây ñể giâm. Dùng dao sắc cắt một mẩu lá cây hoặc cả lá cây gồm cả phần cuống hoặc không cócuống tuỳ theo từng loại cây, sau ñó giải quyết và xử lý auxin vào vết cắt nếu thiết yếu. Ðặt mẩu lá hoặccắm phần cuống lá vào giá thể. Sau một thời hạn trên lá hoặc tại phần cuống sẽ hình thànhrễ bất ñịnh. Nếu phần cuống lá có cả mắt ngủ thì mắt ngủ sẽ bật chồi hình thành cây hoặccũng hoàn toàn có thể tự trên phần lá hình thành chồi mới ñể thành cây mà không cần có mắt ngủ. Trong kỹ thuật giâm cành cần quan tâm : – Giá thể là cát ẩm dùng ñể giâm cành là tốt nhất, có nhiều loại cát như cát thô, cát mịn, cát ñen, cát vàng tuỳ theo từng ñối tượng cây cối mà sử dụng loại cát nào cho thíchhợp. Cát có ñặc tính trơ, thoát nước và xốp sẽ tạo ñiều kiện thuận tiện cho sự ra rễ. Cát dùnglàm giá thể phải sạch ñể tránh nấm, khuẩn hoặc những tạp chất làm chết cành giâm. Thườngsử dụng loại cát mới khai thác hoặc cát cũ thì phải ñược rửa sạch bằng cách ngâm cát trongHCl hoặc thuốc tím trong vài giờ sau ñó rửa nhiều lần dưới vòi nước – Cành mới giâm vẫn xảy ra quy trình thoát hơi nước trên mặt phẳng lá nhưng cành giâmchưa có rễ ñể hút nước dẫn ñến mất cân đối nước, cành giâm bị héo và chết. Vì vậy, cầnphải liên tục phun ẩm ñảm bảo ñộ ẩm bão hoà trên mặt phẳng lá làm giảm sự thoát hơinước cho ñến khi cành giâm Open rễ bất ñịnh4. 3. Nhân giống vô tính bằng chiêu thức ghépGhép là giải pháp ñược thực thi bằng cách lấy một bộ phận của những cây giốngtốt, ñang sinh trưởng như ñoạn cành, ñoạn rễ, mầm ngủ lắp ñặt vào vị trí thích hợp trêncây khác gọi là gốc ghép ñể tạo thành một tổng hợp ghép, cùng sinh trưởng tăng trưởng và tạonên một cây mới hoàn hảo. a. Cơ sở khoa học của giải pháp ghépPhương pháp ghép dựa vào ñặc tính tái sinh liền vết thương của cây. Tế bào tại phần bịthương trên cây có năng lực tái phân loại liên tục thành một ñám tế bào ñể liền vết thươngvà đảm nhiệm phần ñược ghép vào cây. Khi ghép cần áp sát phần mô phân sinh tượng tầng của phần ghép với gốc ghép, tại ñómô phân sinh của gốc ghép hoạt ñộng mạnh làm lấp ñầy chỗ trống giữa hai vết cắt, những tổchức mô tế bào của phần ghép và gốc ghép từ từ hoà hợp, gắn với nhau. Hệ thống mạchTrường ðại học Nông nghiệp TP. Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 11 floem và xylem dần ñược link lại với nhau và thông suốt. Lúc này, chồi ghép ñượccung cấp chất dinh dưỡng và nước nên bắt ñầu sinh trưởng, gốc ghép và chồi ghép trởthành một khung hình mới. Cây nhân giống bằng chiêu thức ghép vẫn trọn vẹn giữ ñược những tính trạng nhưcây mẹ. b. Mục ñích và những ưu nhựơc ñiểm của chiêu thức ghép * Mục ñích – Nhân giống vô tính cây xanh trong trường hợp những giải pháp nhân giống khác khóthực hiện hoặc kém hiệu suất cao. – Thay ñổi một phần hoặc một bộ phận của cây này bằng một phần hoặc bộ phận củacây giống khác. – Tận dụng những ưu ñiểm của gốc ghép cho những cây cối cần nhân giống – Cải tạo những phần bị hại ( gãy, sâu bệnh ) của cây – Sử dụng chiêu thức ghép ñể test cây chống chịu bệnh * Ưu ñiểm : – Giữ ñược hầu hết những tính trạng của cây mẹ – Hệ số nhân giống cao, cây ghép có tuổi thọ cao – Có năng lực thay ñổi giống khi cần mà không phải trồng mới ( giống cũ, năng suấtthấp, sâu bệnh ) hoặc cứu chữa những bộ phận hỏng ( bị hại ở gốc, rễ dẫn tới chết toàn câythì ghép ñể thay rễ ) – Khai thác những ưu ñiểm của cây làm gốc ghép như : năng lực sinh trưởng, khả năngchống chịu sâu bệnh và ñiều kiện ngoại cảnh bất lợi ( hạn, úng, lạnh ) – Sử dụng trong công tác làm việc lai giống * Nhược ñiểm : – Cây sử dụng làm gốc ghép thường trồng bằng hạt nên sinh trưởng không ñồng ñều khóchăm sóc-Cần ñội ngũ kỹ thuật có trình ñộ am hiểu về kỹ thuật ghép, giống cây xanh – Cần ñầu tư nhiều công sức của con người ñể chọn tổng hợp ghép thích hợp tuỳ theo từng loại cây trồngvà từng vùng nhất ñịnhc. Phương pháp ghép mắtTrong kỹ thuật ghép, có 1 số ít hình thức ghép khác nhau như ghép áp, ghép cành, ghép mắt. Tuỳ theo từng ñối tượng cây xanh và mục ñích ghép ñể lựa chọn hình thức ghépthích hợp. Với mục ñích nhân giống vô tính cây cối thường sử dụng hình thức ghép mắt. Ghép mắt có nhiều kiểu ñược gọi theo vết rạch phần gốc ghép : ghép nêm, ghép chữ T, U, H, I, * Ưu ñiểm của chiêu thức : ghép mắt là hình thức ghép rất phổ cập, vận dụng ñượccho nhiều loại giống cây cối khác nhau. Thao tác ñơn giản, thuận tiện. Hệ số nhân giốngcao. Dễ dàng dữ gìn và bảo vệ và luân chuyển vật tư ghép. * Cách triển khai : – Lấy mắt ghép : chọn mắt ghép trên cành ” bánh tẻ “, không bị sâu bệnh ( hình 9.1 ). Tách mắt ghép theo kiểu bóc vỏ ( cành táo ), hoặc cắt vát phần mắt ( cành chanh, bưởi, cam ) ( hình 10.1 a, b, c, d ) Trường ðại học Nông nghiệp TP. Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 12H ình 9.1 : Chọnmắt ghép trên cành ” bánh tẻa b c dHình 10.1 a, b : Tách mắt ghép trên Hình 10.1 c, d : Tách mắt ghép trêncây thân gỗ cây họ cam chanhHình 11.1 : Buộcchặt mắt ghép vàogốc ghépa bHình 12.1. a, b : Mắt ghép sau khi tháo dây buộc ( a ) và nảy chồi ( b ) – Chuẩn bị gốc ghép : dùng dao sắc mở ” hành lang cửa số ” phần vỏ của thân cây. Bóc miếng vỏtrên vết khía. Tiến hành ñặt mắt ghép vào phía trong ” của sổ ” và ñậy hành lang cửa số bằng lớp vỏmới tách, cuốn chặt phần ghép bằng dây nilon mỏng mảnh ( tránh ñể nước mưa gấm vào bêntrong ) ( hình 11.1 ). Sau khoảng chừng 15-20 ngày hoàn toàn có thể mở dây buộc và cắt miếng vỏ ñậy phíangoài miếng ghép ( hình 12.1 a, b ). Ðể kích thích mắt ngủ mọc mầm nhanh, sau khi mở dâybuộc khoảng chừng 7 ngày triển khai cắt ngọn gốc ghép. Thường cắt ngọn gốc ghép cách mắtghép khoảng chừng 2-3 cm, nên cắt nghiêng khoảng chừng 45 về phía ngược chiều với mắt ghép ñểtránh nước nhỏ vào mắt ghép. Phương pháp ghép ” hành lang cửa số ” có tỷ suất sống cao khoảng chừng từ 70-100 % tuỳ theo từng loại cây. 5. Nhân giống vô tính in vitro ( Micro propagation ) Nhân giống vô tính cây cối in vitro hay vi nhân giống ( Micro propagation ) là mộtlĩnh vực ứng dụng có hiệu suất cao nhất trong công nghệ tiên tiến nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ðây làphương pháp nhân giống hiện ñại ñược triển khai trong phòng thí nghiệm nên còn gọi làphương pháp nhân giống trong ống nghiệm. Khác với những phương pháp nhân giống truyền thống lịch sử như giâm, chiết cành hoặc ghépmắt, phương pháp nhân giống in vitro có năng lực trong một thời hạn ngắn, hoàn toàn có thể tạo ramột số lượng cây giống lớn ñồng ñều ñể phủ kín một diện tích quy hoạnh ñất nhất ñịnh mà những phươngpháp nhân giống khác không hề sửa chữa thay thế ñược. Ngoài ra chiêu thức này không phụ thuộcvào ñiều kiện thời tiết nên hoàn toàn có thể thực thi quanh năm. Ðây là một hướng ñang ñược ứng dụngrộng rãi. Ở Nước Ta lúc bấy giờ có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, nhiều TT sảnxuất cây giống hàng nam ñã phân phối một lượng ñáng kể cây giống có chất lượng cao cho sảnxuất như chuối, dứa, khoai tây, những loại lan, hoa lá cây cảnh, cây lâm nghiệp. 5.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nhân giống vô tính in vitroKỹ thuật nuôi cây mô tế bào ( tissue culture ) nói chung và kỹ thuật nhân giống vô tính invitro nói riêng ñều dựa vào cơ sở khoa học là có tính toàn năng, sự phân hoá và phản phân hoá. a. Tính toàn năng của tế bàoHaberland ( 1902 ) lần ñầu tiên ñã ý niệm rằng mỗi một tế bào bất kể của một cơ thểsinh vật ña bào ñều có năng lực tiềm tàng ñể tăng trưởng thành một khung hình hoàn hảo. Theoquan ñiểm của sinh học hiện ñại thì mỗi một tế bào ñã chuyên hoá ñều chứa một lượngthông tin di truyền ( bộ ADN ) tương ñương với lượng thông tin di truyền của một cơ thểTrường ðại học Nông nghiệp TP.HN – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 13 trưởng thành. Vì vậy, trong ñiều kiện nhất ñịnh một tế bào bất kể ñều hoàn toàn có thể phát triểnthành một khung hình hoàn hảo. Ðặc tính ñó của tế bào gọi là tính toàn năng của tế bào. Như vậy, bất kỳ một tế bàonào cũng hoàn toàn có thể hình thành mộtcây hoàn hảo. ðó cũng là cơsở khoa học của kỹ thuật nuôicấy mô tế bào ( in vitro ) nóichung và kỹ thuật nhân giống vôtính ( clone-nhân bản ) nói riêng. Qua ñó người ta hoàn toàn có thể biến mộttế bào bất kể ( hoặc một mẩumô ) thành một khung hình hoànchỉnh khi ñược nuôi cấy trongmột môi trường tự nhiên thích hợp có ñầyñủ những ñiều kiện thiết yếu cho tếbào triển khai những quy trình phânhóa, phản phân hoá ( hình 13.1 ) Hình 13.1 : Sử dụng nuôi cấy những loại mô bất kể trên câyb. Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào + Tính phân hoá của tế bào là sự biến ñổi của những tế bào phôi sinh thành những tế bào củacác mô chuyên hoá ñảm nhiệm những tính năng khác nhau. Trong khung hình thực vật có khoảng15 loại mô khác nhau ñảm nhiệm những công dụng khác nhau ( mô dậu, mô dẫn, mô bì, môkhuyết ) nhưng chúng ñều có cùng nguồn gốc từ tế bào phôi sinh ñã trải qua giai ñoạnphân hoá tế bào ñể hình thành những mô riêng không liên quan gì đến nhau. + Tính phản phân hoá của tế bào : ñó là những tế bào khi ñã ñược phân hoá thành những môriêng biệt với những công dụng khác nhau nhưng trong ñiều kiện nhất ñịnh chúng vẫn có thểquay trở về trạng thái phôi sinh ñể phân loại tế bào. Ðó là tính phản phân hoá của tế bào. Trong kỹ thuật nuôi cấy những cơ quan dinh dưỡng của cây như lá, thân, thì giai ñoạntạo mô sẹo ( callus ), ñây chính là những tế bào ñã quay trờ về trạng thái phôi sinh có khảnăng phân loại liên tục mà mất hẳn công dụng của những cơ quan dinh dưỡng như lá, thântrước ñó. Sự phân hóa và phản phân hoá giữa tế bào phôi sinh và tế bào ñã chuyên hoá ñược biểudiễn theo sơ ñồ sau : Phân hoá tế bàoTế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoáPhản phân hóaVề thực chất sự phân hoá và phản phân hoá là quy trình hoạt hoá gen. Tại một thời ñiểmnào ñó trong quy trình tăng trưởng thành viên thì 1 số ít gen ñược hoạt hoá và một số ít gen khác bịức chế. Ðiều này xảy ra theo một chương trình ñã ñược mã hoá trong cấu trúc phân tửADN. Khi nằm trong một khung hình hoàn hảo giữa những tế bào có sự ức chế lẫn nhau, nhưngkhi ñược tách rời và trong những ñiều kiện nhất ñịnh thì những gen ñược hoạt hoá dễ dànghơn nên chúng có năng lực mở toàn bộ những gen ñể hình thành một thành viên mới. Ðó chính là cơsở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. 5.2. Mục ñích của phương pháp nhân giống vô tính in vitroTrong nghành nghề dịch vụ nhân giống vô tính in vitro thì kỹ thuật nhân nhanh giống cây trồngphục vụ những mục ñích sau : Trường ðại học Nông nghiệp TP. Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 14 – Nhân nhanh những kiểu gen quý và hiếm làm vật tư cho công tác làm việc tạo giống – Nhân nhanh và duy trì những thành viên ñầu dòng tốt ñể phân phối cây giống của những những loạicây trồng khác nhau như cây lương thực, cây rau, cây hoa, hoa lá cây cảnh, cây dược liệu, câylâm nghiệp – Nhân nhanh tích hợp với làm sạch virút. – Bảo quản những tập ñoàn gen, ñặc biệt ñối với loại cây dễ bị nhiễm bệnh trong ñiều kiệntự nhiên ( khoai tây, khoai lang, ) hoặc những cây dễ bị giao phấn. 5.3. Ưu, nhược ñiểm của phương pháp nhân giống vô tính in vitroPhương pháp nhân giống vô tính in vitro ñã ñược E.F. Gerge ( 1993 ) nêu lên một số ít ưu, nhược ñiểm chính sau ñây : a. Những ưu ñiểm – Phương pháp nhân giống in vitro có năng lực hình thành ñược số lượng lớn cây giốngtừ một mô, cơ quan của cây với kích cỡ nhỏ khoảng chừng 0,1 – 10 mm. Trong khi ñó phươngpháp nhân giống truyền thống cuội nguồn ( giâm chiết cành ) thì ñể tạo thành một cây giống, ít nhấtphải sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích cỡ từ 5-20 cm – Hoàn toàn triển khai trong ñiều kiện vô trùng nên cây giống tạo ñược sẽ không bịnhiễm bệnh từ thiên nhiên và môi trường bên ngoài. – Sử dụng vật tư sạch virút và có năng lực nhân nhanh số lượng lớn cây sạch virút. – Hoàn toàn chủ ñộng ñiều chỉnh những tác nhân ñiều chỉnh năng lực tái sinh của cây nhưthành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt ñộ, chất ñiều tiết sinh trưởng theo ý muốn – Hệ số nhân giống cao nên có năng lực sản xuất số lượng lớn cây giống trong một thờigian ngắn. Hệ số nhân giống ở những loại cây nằm trong khoảng chừng từ 3 ñến 1012 / năm, nhưvậy không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có thông số nhân giống cao hơn – Có thể triển khai quanh năm mà không bị chi phối bởi ñiều kiện ngoại cảnh của thờivụ. – Cây giống in vitro nếu chưa có nhu yếu sử dụng thì hoàn toàn có thể dữ gìn và bảo vệ ñược trong thờigian dài trong ñiều kiện in vitrob. Những nhược ñiểm – Mặc dù có thông số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra có kích cỡ nhỏ và ñôi khixuất hiện những dạng cây không mong ước ( biến dị, mọng nước ). – Cây giống in vitro do ñược cung ứng nguồn hydrat carbon tự tạo nên năng lực tựtổng hợp những vật tư hữu cơ ( tự dưỡng ) của cây kém. Ðồng thời, cây giống in vitro ñượcnuôi dưỡng trong bình thuỷ tinh hoặc bình nhựa nên ñộ ẩm không khí thường bão hoà. Doñó, khi trồng cây ra ngoài ñiều kiện tự nhiên cây thường bị mất cân đối nước, gây hiệntượng cây bị héo và chết. Vì vậy, trước khi chuyển cây từ ñiều kiện in vitro ra ñiều kiện invivo, cây cần trải qua giai ñoạn ” đào tạo và giảng dạy ” ñể quen dần với ñiều kiện môi trường tự nhiên bênngoài có ñộ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh. – Cần trang thiết bị hiện ñại, kỹ thuật viên có kinh nghiệm tay nghề cao. 5.4. Ðiều kiện thiết yếu của nuôi cấy in vitro * Ðiều kiện thứ nhất là vô trùng. Tất cả những khâu nuôi cấy ñều ñược thanh trùng : dụngcụ nuôi cấy, mẫu nuôi cấy, thiên nhiên và môi trường ( giá thể ) và những thao tác nuôi cấy Sự thành cônghay thất bại của việc làm nuôi cấy mô là nhờ vào vào việc vô trùng. Nếu có một khâunào ñó không vô trùng thì mẫu nuôi cấy lập tức bị nhiễm vi sinh vật hoặc nấm và sẽ chết. Khử trùng ñược thực thi bằng những phương tiện đi lại sau : – Nồi hấp : khử trùng bằng hơi nước có nhiệt ñộ và áp suất cao. Thường vận dụng tiệttrùng cho thiên nhiên và môi trường nuôi cấy, dụng cụ cấy ( chai, lọ, panh, dao, kéo, bông ) Với áp suất 1 atm tương ñương với 121C trong khoảng chừng thời hạn từ 20 phút ñến 30 phút là ñảm bảo khửtrùng tốt. – Tủ sấy : khử trùng bằng nhiệt ñộ cao nên chỉ vận dụng khử trùng cho những dụng cụ thuỷtinh và dụng cụ cấy mẫu bằng sắt kẽm kim loại. Trường ðại học Nông nghiệp TP.HN – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 15 – Phễu lọc vô trùng ( Microspore ) : khử trùng qua phễu lọc có màng lọc kích cỡ nhỏ ( 0,2 µm ), chỉ vận dụng ñối với dung dịch trong ñiều kiện nhiệt ñộ và áp suất cao sẽ bị phânhuỷ như vitamin B, gibberellin – Hoá chất khử trùng : vận dụng ñể khử trùng mặt phẳng mẫu cấy hoặc ñốt dụng cụ, thườngdùng : Ca-hypocloride, Na-hypocloride, clorua thuỷ ngân ( HgCl ), nước brôm, oxy già ( H ), cồn * Phòng nuôi cấy mô là phòng thí nghiệm chuyên hoá cao với những thiết bị chuyên được dùng. Bao gồm một phòng chuẩn bị sẵn sàng mẫu, phòng cấy mẫu, phòng nuôi cây và nhà lưới ñể ñưa câyra ñất. Tuỳ theo quy mô và mục ñích mà diện tích quy hoạnh những bộ phận khác nhau. Các thiết bịquan trọng nhất của phòng nuôi cấy mô gồm có nồi hấp ñể vô trùng dụng cụ và mẫu nuôicấy, máy cấy vô trùng ñể thao tác cấy mẫu, phòng nuôi có ñủ ánh sáng tự tạo và ñiềuhoà nhiệt ñộ ñể nuôi câyHình 14.1 ñến hình 17.1. Trang thiết bị và phòng nuôi cấy mô tại Bộ môn Sinh lý thựcvật – khoa Nông học – ðHNNI. a. Tủ sấy ( khử trùng khô ) b. Nồi hấp ( khử trùng ướt ) c. Cân nghiên cứu và phân tích, cân kỹ thuậtd. Máy ño pHHình 14.1 ( a, b, c, d ) : Các thiết bị trong phòng chuẩn bị sẵn sàng môi trườngHình 15.1 : Tủ cấy mẫu vô trùng ( a. Tủ cấy ñơn ; b. Tủ cấy ñôi ) Trường ðại học Nông nghiệp TP. Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 16H ình 16.1 : Buồng nuôi cấy Hình 17.1 : Vườn ươm cây – Môi trường nuôi cấy là giá thể có ñầy ñủ chất dinh dưỡng, những hoạt chất như cácnguyên tố vi lượng, vitamin, chất ñiều hoà sinh trưởng. Tuỳ theo từng loại cây và cơ quannuôi cấy mà người ta ñã có những thiên nhiên và môi trường riêng cho chúng. Ví dụ : Môi trường cơ bảnnhất là thiên nhiên và môi trường MS ( Murashige Skoog ) cho nhiều ñối tượng cây xanh, môi trườngAdnerson cho cây thân gỗ, thiên nhiên và môi trường Gamborg cho nuôi cấy tế bào trần, môi trườngCHU cho nuôi cấy bao phấn5. 5. Thành phần môi trường tự nhiên dinh dưỡngNăm 1898, Haberland ñề xướng ra tính toàn năng của tế bào và ông thực thi những thínghiệm ñầu tiên về nuôi cấy mô nhưng những thí nghiệm ñều không thành công xuất sắc. Khi ñó donhững hiểu biết về nhu yếu dinh dưỡng khoáng của mô và tế bào thực vật còn rất hạn chế, ñặc biệt là vai trò của những chất ñiều tiết sinh trưởng phần đông chưa ñược tò mò. Ðến nay ñã có hàng trăm loại thiên nhiên và môi trường dinh dưỡng tự tạo ñã ñược kiến thiết xây dựng vàthử nghiệm có tác dụng. Hầu hết những loại thiên nhiên và môi trường ñều gồm có những nhóm chất chínhsau ñây : + Các loại muối khoáng + Nguồn carbon hữu cơ + Vitamin + Chất ñiều tiết sinh trưởng + Nhóm chất tự nhiên + Chất làm ñông môi trườnga. Các loại muối khoángCác nguyên tố khoáng dùng trong môi trường tự nhiên dinh dưỡng cho nuôi cấy mô, tế bào thựcvật ñược phân loại thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng : nhóm nguyên tố ña lượng vànhóm nguyên tố vi lượng. * Các nguyên tố khoáng ña lượngBao gồm những nguyên tố khoáng có trong thành phần dinh dưỡng của môi trường tự nhiên vớinồng ñộ trên 30 ppm ( part per million ). Gồm những nguyên tố : N, P., K, S, Mg, Ca – Nitơ ( N ) : ñược sử dụng ở dạng NOvà NHriêng rẽ hoặc phối hợp cả hai loại – Lưu huỳnh ( S ) : thường sử dụng dạng SO2 -. những loại SOhoặc SOthường kém tácdụng, thậm trí còn ñộc. – Phospho ( P. ) : mô và tế bào nuôi cấy có nhu yếu về phospho rất cao. Phospho là mộttrong thành phần cấu trúc phân tử axit nucleic và phân tử nguồn năng lượng ATP. Ngoài raphospho ở dạng HPOvà HPOcòn có tính năng như mạng lưới hệ thống ñệm ( buffer ) làm ổn ñịnhpH của môi trường tự nhiên trong quy trình nuôi cấy. – Kali và can xi ( K và Ca ) : ở dạng ion K, Ca2 + tế bào và mô thuận tiện hấp thu và ñồnghoá * Các nguyên tố vi lượng : Bao gồm những nguyên tố có trong thành phần dinh dưỡng của thiên nhiên và môi trường nuôi cấy vớinồng ñộ thấp hơn 30 ppm. Ðó là những nguyên tố : Fe, B, Mn, Mo, Cu, Co, NiTrường ðại học Nông nghiệp TP.HN – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 17 – Sắt ( Fe ) : sắt thường tạo phức với những thành phần khác làm mất năng lực giải phóngion sắt cho nhu yếu của cây. Vì vậy, thường sử dụng sắt ở dạng phức chelat với citrat hoặcvới EDTA ( Ethylene Diamine Tetraacetic Acid ). Từ phức sắt này ion Fe ñược giải phóngtrong khoanh vùng phạm vi pH khá rộng. Sắt quyết ñịnh năng lực phân loại của tế bào. Thí nghiệm với sắt ñánh dấu bằng ñồngvị phóng xạ59Fe cho thấy sắt ñược dự trữ trong nhân tế bào rất nhiều. Thiếu sắt sẽ làmgiảm lượng ARN và giảm năng lực sinh tổng hợp protein, nhưng làm tăng lượng AND. – Bo ( B ) : ñóng vai trò quan trọng trong sự hình thành nên thành tế bào và màng tế bàothực vật. Nếu thiếu Bo sẽ ức chế sự phát sinh rễ thứ cấp và ức chế sinh trưởng chiều dàicủa rễ. Bởi vì, khi thiếu Bo sẽ kích thích hoạt tính của enzym IAA oxidaza nên hàm lượngcủa IAA bị giảm. Thiếu Bo thì mô nuôi cấy sẽ chuyển hoá thành mô sẹo, nhưng thường làmô sẹo xốp, mọng nước, năng lực tái sinh chồi kém. – Ðồng ( Cu ) : cây hấp thu dạng ion Cu2 +. Khoảng 50 % Cu2 + xuất hiện trong lục lạp. Ðồnglà thành phần của một số ít enzyme, là thành viên của chuỗi luân chuyển ñiện tử của hệ thốngquang hoá I và II trong quang hợp. Vì vậy, thiếu ñồng sẽ làm giảm nhanh gọn hoạt ñộngquang hợp. – Mangan ( Mn ) : thiếu Mn làm cho hàm lượng những amino axit tự do và ADN tăng lên, nhưng lượng ARN và năng lực sinh tổng hợp protein bị giảm dẫn ñến năng lực phân bàokém. Mangane xúc tác cho phản ứng quang phân ly nước trong quang hợp. – Molypden ( Mo ) : là ion ñóng vai trò co-factor trong mạng lưới hệ thống nitrat reductaza, thế cho nên, Mo ñóng vai trò quan trọng trong quy trình trao ñổi ñạm trong tế bào. – Kẽm ( Zn ) : là ion tham gia vào en zyme tổng hợp ARN, trong ARN-polimeraza chứahai ion Zn. Nồng ñộ Zn thấp sẽ làm tăng hoạt ñộng của en zyme phân giải ARN ( RNAse ). Xúc tác cho phản ứng tổng hợp IAA. – Coban ( Co ) : có vai trò quan trọng trong quy trình có ñịnh nitơ, tổng hợp ARN vàmethionine. b. Nguồn carbon hữu cơ : mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếutheo phương pháp dị dưỡng, cũng hoàn toàn có thể sống bán dị dưỡng nhờ vào năng lực quang hợptrong ñiều kiện ánh sáng tự tạo, nhưng rất yếu nên không ñủ nguồn carbon hữu cơ chosự sinh trưởng tăng trưởng của cây. Vì vậy, trong môi trường tự nhiên nuôi cấy cần ñược bổ sungnguồn carbon hữu cơ và thường dùng saccaroza với liều lượng 2-3 %. Trong một số ít trườnghợp ñặc biệt như nuôi cấy bao phấn lúa, nuôi cấy tế bào trần hoàn toàn có thể dùng glucoza, maltoza, galactozac. VitaminMặc dù mô và tế bào nuôi cấy in vitro ñều có năng lực tự tổng hợp ñược những loạivitamin thiết yếu, nhưng thường không ñủ về lượng, do ñó phải bổ trợ thêm từ bên ngoàivào, ñặc biệt là vitamin thuộc nhóm B với nồng ñộ khoảng chừng 1 ppm. + Vitamin B1 ( Thiamin. HCl ) : khi khử trùng thiên nhiên và môi trường bằng nồi hấp ở nhiệt ñộ và ápsuất cao thì bị phân tách thành pyrimidin và thiazol nhưng sau ñó tế bào lại có khả năngtổng hợp chúng lại thành vitamin B1. + Vitamin B2 ( Riboflavin ) : hoàn toàn có thể khử trùng bằng nhiệt nhưng lại dễ bị ánh sáng làmphân giải. Ðối với nuôi cấy ngoài sáng thì chỉ dùng nồng ñộ 0,01 ppm. nhưng ñối với nuôicấy trong tối hoàn toàn có thể tăng lên 10-15 ppm. + Vitamin B6 ( Pyridoxin ) : là tiền thân của pyridoxalphosphat – cofactor của những nhómenzym như carboxylaza và transaminaza. Khi hấp ở nhiệt ñộ cao xảy ra phản ứng : pyridoxin + phosphat > pyridoxalphosphat + Mio Inositol : có vai trò quan trọng cho sự phân loại tế bào vì thúc ñẩy sự hình thànhthành tế bào ( sinh tổng hợp polygalacturonic axit và pectin ). Thường sử dụng ở nồng ñộcao 50-100 ppm. Trong nước dừa cũng có inositol. + Pantotenic axit : là thành phần của coenzym A.Trường ðại học Nông nghiệp TP.HN – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 18 d. Nhóm chất tự nhiênCác nhà sáng lập ngành nuôi cấy mô trước ñây thường sử dụng thiên nhiên và môi trường dinh dưỡngrất ñơn giản chỉ bào gồm muối khoáng và ñường. Ngày nay người ta ñã khẳng ñịnh rằngloại môi trường tự nhiên ñơn giản như vậy chưa ñủ cho tế bào sinh trưởng tốt. Vì vậy, thành phầnmôi trường ngày càng đa dạng chủng loại, ñầy ñủ và phức tạp hơn. Người ta ñã bổ trợ vào môitrường 1 số ít nhóm chất tự nhiên nhằm mục đích làm ngày càng tăng thành phần dinh dưỡng và cũng có cảcác chất có hoạt tính sinh lý nên kích thích sự sinh trưởng tăng trưởng của cây in vitro. Thường gồm có : + Nước dừa : theo tác dụng nghiên cứu và phân tích thành phần nước dừa của Tulecke và ctv ( 1961 ) chothấy trong nước dừa có nhiều nhóm chất thiết yếu cho sự sinh trưởng của tế bào như : Axit amin, axit béo, axit hữu cơ, ñường, ARN, ADN, myo inositol, những chất có hoạt tínhauxin, những glucosit của xytokinin + Dịch chiết nấm men : White ( 1934 ) lần ñầu tiên ñã nuôi cấy thành công xuất sắc rễ cây càchua trong môi trường tự nhiên có dịch chiết nấm men. Thành phần của dịch chiết nấm men gồm có : ñường, nucleic axit, amino axit, vitamin, axin, khoáng. Tác dụng của dịch chiết nấm mencho sự sinh trưởng của rễ rất tốt nhưng với mô sẹo thì không tốt. + Dịch chiết mầm lúa mì ( mạch nha ) : chứa hầu hết 1 số ít ñường, vitamin và một sốchất có hoạt tính ñiều tiết sinh trưởng. + Dịch chiết một số ít loại rau, quả tươi ( khoai tây, chuối, cà rốt ) thành phần có ñường, axitnucleic, axit amin, vitamin, khoánge. Chất làm ñông môi trường tự nhiên ( Agar ) Agar – là một loại polysacarit của tảo ( hầu hết tảo hồng – Rodophyta ). Agar khi ngâm nướcở 80C sẽ chuyển sang dạng sol và 40C thì quay trở lại trạng thái gel. Khả năng ngậm nước củaagar cao ( 6-12 g / 1 lit nước ). Tuy ở trạng thái gel nhưng agar vẫn ñảm bảo cho những ion vậnchuyển thuận tiện. Vì vậy, thuận tiện cho sự hút dinh dưỡng của cây tronng nuôi cấy mô. g. Chất ñiều tiết sinh trưởngTrong môi trường tự nhiên nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần phụ gia quan trọng nhấtquyết ñịnh ñến tác dụng của nuôi cấy in vitro ñó là những chất ñiều tiết sinh trưởng. Nhóm cácnhà khoa học ở Netherandl do giáo sư F.T.M. Kors chủ biên trong cuốn ” Catalo 2000 – 2001 ” ñã tóm tắt vai trò của những chất ñiều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô theo bảngdưới ñây : CHẤT ÐIỀU TIẾT SINH TRƯỞNG VAI TRÒ TRONG NUÔI CẤY MÔNHÓM AUXINIndol-3acetic axit ( IAA ) – Phát sinh rễ bất ñịnh ( ở nồng ñộ cao ) Indol-3butyric axit ( IBA ) – Phát sinh chồi bất ñịnh ( ở nồng ñộ thấp ) Naphthaleneacetic axit ( NAA ) – Tạo phôi vô tính ( 2,4 D ) Phenylacetic axit ( PAA ) – Phân chia tế bào2, 4 dichlorophenoxyacetic axit ( 2,4 D ) – Phát sinh và sinh trưởng callus2, 4,5 trichlorophenoxyacetic axit ( 2,4,5 T – ức chế bật chồi bênP-chlorophe noxyacetic axit ( CPA ) – Ức chế sinh trưởng của rễCYTOKININZeatin ( Z ) – Phát sinh chồi bất ñịnh ( ở nồng ñộ cao ) Zeatinriboside ( ZR ) – ức chế sự phát sinh rễIsopentenyladenin ( iP ) – Thúc ñẩy sự phân loại tế bàoIsopentenyladenosin ( iPA ) – Kích thích sự bật chồi bên6 – benzylaminoburin ( BAP ) – Ức chế sự lê dài của chồiKinetin – Ức chế sự hoá giàThidiazuron ( TDZ ) N ( 2 – chloro-4pyridil ) Nphenylurea ( CPPU ) Trường ðại học Nông nghiệp TP.HN – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 19GIBBERELLING ibberellic Axit ( GA3 ) – Vươn dài chồi, phá ngủ của hạt, củGibberellin 1 ( GA1 ) – Phá ngủ của hạt, phôi vô tính, chồi bênGibberellin 4 ( GA4 ) – ức chế phát sinh rễ bất ñịnhGibberellin 7 ( GA7 ) – Kích thích sự hình thành chất ức chếcủa quy trình trình tạo rễ, ra củ, rẻ hànhABSCISIC AXIT – Làm chín phôi vô tính – Kích thích phát sinh chồi, củ – Ðiều khiển sự ngủ nghỉETHYLEN – Hoá già lá – Làm chín quảPOLYAMIN – Thúc ñẩy sự phát sinh rễ bất ñịnh – Thúc ñẩy sự phát sinh chồi – Thúc ñẩy sự hình thành phôi vôi tínhJASMONIC AXIT – Thúc ñẩy sự phát sinh củ, dẻ hành – Làm tăng sự hình thành meristemh. ðộ pH của môi trường tự nhiên. pH của môi trường tự nhiên nuôi cấy thích hợp cho ña số những loại cây xanh dao ñộng từ 5,5 – 6,0. Nếu pH thấp thì agar sẽ không ñông sau khi hấp khử trùng. Khi pH < 4 hoặc pH > 7 thì sẽ làm kết tủ 1 số ít muối vô cơ và phân giải một số ít chất hữu cơ sẽ làm chết cây. 5.6. Các phương pháp nhân giống vô tính in vitroCó hai hình thức nhân giống vô tính in vitro : + Nhân giống vô tính bằng cách tạo cây từ chồi nách, chồi ñỉnh hoặc mô phân sinh. Tuỳ theo từng mục ñích mà tất cả chúng ta sử dụng nguồn ñể nuôi cấy là chồi nách, chồi ñỉnhhoặc mô phân sinh. Hình 18.1. Nuôi cấy chồi nách, chồi ñỉnhHình 19.1 : Mô phân sinh ñỉnh ( meristem ) Trường ðại học Nông nghiệp TP. Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 20K hái niệm mô phân sinh ( meristem ) chỉ ñúng khi mẫu nuôi cấy ñược tách từ ñỉnh sinhtrưởng có size khoảng chừng từ 0,1 – 0,5 mm. Khi với mục ñích nuôi cấy làm sạch viruscho cây cối thì bắt buộc phải nuôi cấy meristem. Tỷ lệ thành công xuất sắc trong kỹ thuật nuôicấy meristem thường không cao. Tuy nhiên, cho ñến nay người ta ñã nuôi cấy thành côngcho nhiều ñối tượng cây xanh tạo cây sạch bệnh như khoai tây, khoai lang, dứa, míaQuy luật về sự đối sánh tương quan giữa ñộ lớn của chồi nuôi cấy với tỷ suất sống và mức ñộ ổnñịnh về mặt di truyền của chồi ñược biểu lộ như sau : khi kích cỡ chồi nuôi cấy càngtăng thì tỷ suất sống và tính ổn ñịnh cũng càng tăng và ngược lại kích cỡ chồi nuôi cấycàng nhỏ thì tỷ suất sống và tính ổn ñịnh cũng giảm. Nhưng xét về hiệu suất cao kinh tế tài chính trong nuôi cấy mô thì : nếu size của chồi nuôi cấytăng thì hiệu suất cao kinh tế tài chính giảm và ngược lại kích cỡ của chồi nuôi cấy giảm thì hiệu quảkinh tế lại tăng ( thể tích bình nuôi, lượng thiên nhiên và môi trường ) Khi sử dụng mẫu nuôi cấy là chồi nách hoặc chồi ñỉnh thì năng lực nuôi cấy thành cônglà rất cao do tại ñây là hình thức phát ñộng sự sinh trưởng của chồi hoặc phá ngủ chồi nênchồi sinh trưởng thuận tiện ñể hình thành cây. Hình thức này thường sử dụng cho những loạicây hai lá mầm như khoai tây, cam, chanh, thuốc lá Tuy nhiên cũng có một số ít cây mộtlá mầm như dứa quả, dứa sợi + Nhân giống vô tính bằng phát sinh chồi bất ñịnh ( adventitiou shoots ) hoặc phôi vôtính ( somatic embryos ) Chồi hoàn toàn có thể hình thành bằng hình thức trực tiếp hoặc gián tiếp : – Chồi phát sinh trực tiếp từ một mẩu mô hoặc cơ quan tách ra từ cây mẹTrên khung hình cây, ngoài mô phân sinh và ñỉnh sinh trưởng là nguồn mẫu nuôi cấy như ñãtrình bày ở trên thì những bộ phận còn lại ñều hoàn toàn có thể sử dụng cho việc nhân giống in vitro. Các bộ phận ñó là : Ðoạn thân : thuốc lá, cam, chanhMảnh lá : thuốc lá, cà chua, bắp cảiCác bộ phận của hoa : suplơ, lúa mỳ, ñồng tiền, phong lanNhánh củ, bẹ củ : hành tỏi, họ hoa huệ Liliaceae, IridaceaeeTrong trường hợp này cần phải triển khai quả trình phản phân hoá và tái phân hoá tế bàoñể bắt những tế bào dinh dưỡng hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trải qua giai ñoạnphát triển mô sẹoỞ những ñối tượng một lá mầm như lan, dưa, chuối, hoa loa kèn sự tăng trưởng chồithường phải qua giai ñoạn dẻ hành ( protoccorm ), như vậy, mẫu cấy sẽ hình thành hàng loạtthể protocorm, tiếp theo, những protocorm sản sinh protocorm mới hoặc tăng trưởng thành câyHình 20.1. Thể protocorm vàự phát sinh chồitừ protocorm câyphong lanTrường ðại học Nông nghiệp TP. Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 21T uy nhiên, vớimục ñích nhân giốngvô tính, thì hình thứctái sinh cây trực tiếptừ mẫu nuôi cấykhông qua giai ñoạncallus ( mô sẹo ) sẽrút ngắn thời hạn tạocây ñồng thời câyñồng nhất về mặt ditruyền. Chồi phát sinhgián tiếp qua giaiñoạn mô sẹo sẽlâu cho cây và môsẹo khi cấy chuyểnnhiều lần thườngkhông ổn ñịnh về mặtdi truyền nên cây hayxuất hiện dạng bấtthườngVì vậy, ñể tránhtrường hợp ñó ngườita chỉ sử dụng mô sẹovừa phát sinh tức làmô sẹo sơ cấp ñể phátsinh cây thì giảm ñược hiện tượng kỳ lạ biến dị. Từ tế bào mô sẹo cũng hoàn toàn có thể tái sinh trực tiếp thành cây hoặc hoàn toàn có thể phải qua giai ñoạntạo phôi vô tính ( somatic embryos ) ñể thành cây. 5.7. Các bước thực thi trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bàoCho tới nay việc sử dụng phương pháp nhân giống in vitro ñã ñược vận dụng cho nhiềuloại cây cối ( trên 400 loài ). Giáo sư Murashige của trường Ðại học California ñã chiaquy trình nhân giống in vitro làm ba giai ñoạn ( Murashige, 1974 ) và một giai ñoạn tiếp sauin vitro : 1 ) Tạo vật liệu nuôi cấy khởi ñầu in vitro2 ) Nhân nhanh chồi, cụm chồi in vitro3 ) Tạo cây hoàn hảo, giảng dạy cây con4 ) Chuyển cây ra trồng ngoài ñiều kiện tự nhiênBa giai ñoạn nhân cây in vitro ñược Edwin F. George ( 1993 ) tóm tắt trong bảng dướiñây : Hình 21.1 : Nuôi cấy qua giai ñoạn callusHình 22.1 : Nuôi cấy mô phân sinh ñỉnh ( meristem ) a, b môphân sinh ; c tái sinh cây ; d, e cây hoàn chỉnhTrường ðại học Nông nghiệp TP. Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 22C ác giai ñoạn nuôi cấy in vitro1 ) Tạo vật liệu nuôicấy khởi ñầu in vitro2 ) Nhân nhanh chồi, cụmchồi in vitro3 ) Tạo cây hoànchỉnh, huấn luyệncây conCác hình thứcnhân cây in vitroYêu cầu : mô, cơ quankhoẻ, sạch những vi sinhvậtYêu cầu : thông số nhân chồihoặc phôi vô tính cao, chồikhoẻYêu cầu : cây conhoàn chỉnh, khoẻmạnh, tỷ suất sốngcaoNuôi cấy chồiMẫu sử dụng là chồiñỉnh hoặc chồi bên ñượccấy vào thiên nhiên và môi trường lỏnghoặc ñặc ñể khởi ñộngcho sự sinh trưởng chồi. Chồi sinh trưởng ñạtchiều cao 10 mmNhân nhanh chồi nách ( axilary shoots ) hoặc cụmchồi ( adventitiou shoots ) vàkhi chồi sinh trưởng ñủ kíchthước thì tách riêng chồi ñểnhân tiếp giai ñoạn 2 hoặcchuyển sang giai ñoạn 3S inh trưởng tiếpvề chiều cao chồitương tự giai ñoạn2. Ra rễ tạo cây invitro hoàn chỉnhNuôi cấy môphân sinh ñỉnh ( Meristem ) Mẫu sử dụng là ñỉnhsinh trưởng với kíchthước rất nhỏ ( 0,1 – 0,5 mm ) ñể nuôi cấy. Cũngcó thể sử dụng ñỉnh sinhtrưởng kích cỡ lớnhơn ( 1-2 mm ) từ nhữngmẫu ñã giải quyết và xử lý nhiệt ñộ. Sinh trưởng chồi ñạt 10 mm, sau ñó nhân nhanh chồihoặc cụm chồi và chuyểnsang giai ñoạn 3T ương tự nhưphần trênNuôi cấy ñốtthânCũng như nuôi cấychồi ñỉnh nhưng mẫu sửdụng là 1 ñoạn của ñốtthânNhân nhanh bằng việc giatăng chồi bên. Mỗi một ñốt sẽsinh trưởng thành chồi riêngbiệt. Cấy chuyển hoàn toàn có thể lặplại nhiều lần hoặc vô hạn. Tương tự nhưphần trênNuôi cấy mô, cơquan – Tái sinhchồi trực tiếpMẫu sử dụng nuôicấy tuỳ thuộc vào từngloại cây : lá, thân, rễ, hoa ñã ñược khử trùngTái sinh chồi trực tiếp từmô, cơ quan nuôi cấy màkhông qua giai ñoạn callus. Chồi phát sinh sẽ ñược nhânnhanh ở giai ñoạn 2 theo kiểunhân cụm chồi hoặc nhânchồi ñỉnh. Tương tự nhưphần trênNuôi cấy mô, cơquan – Tái sinhchồi gián tiếpqua callusTương tự như phần trênPhát sinh callus, táchriêng callus ñể cấy chuyểntrong môi trường tự nhiên nhânnhanh. Sau ñó chuyển sangmôi trường tái sinh chồi. Chồi sinh trưởng ñạt chiềucao 10 mmChồi ñược táchriêng biệt và cho rarễ tạo cây hoànchỉnhTái sinh câytrực tiếp từ phôivô tính ( somaticmbryo ) Mô, cơ quan ñượcnuôi cấy tạo phôi vôtính tuỳ thuộc từng loạicây. Tái sinh trực tiếp phôi vôtính trên những mẫu nuôi cấymà không có callus. Nhânnhanh phôi vô tínhPhôi vô tínhsinh trưởng hìnhthành cây hoànchỉnh2. Hình thức tạocủ in vitro ( microtuber ) Mẫu nuôi cấy giống nhưnhân cây in vitro, tức làcó thể dùng chồi ñỉnh, chồi nách, vảy củ ñểphát sinh cây in vitroKhi cây ñạt trạng tháidinh dưỡng nhất ñịnh thìchuyển vào môi trường tự nhiên tạocủ, ñặt trong tối hoặc ánhsáng ngày ngắnSau 2-3 tháng thìthu hoạch. Bảoquản củ trong kholạnhTrường ðại học Nông nghiệp TP. Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 23 • Giai ñoạn 1 : Tạo vật liệu khởi ñầu in vitroLựa chọn, ñưa mẫu vào nuôi cấy phải ñảm bảo nhu yếu : – Tỷ lệ nhiễm thấp – Tỷ lệ sống cao – Tốc ñộ sinh trưởng nhanhKết quả giai ñoạn này nhờ vào rất nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào mục ñích khácnhau, loại cây khác nhau ñể lấy mẫu nuôi cấy tương thích hoàn toàn có thể sử dụng ñỉnh sinh trưởng, chồinách, hoa, thân, rế, lá Khi lấy mẫu cần chọn ñúng loại mô, ñúng giai ñoạn tăng trưởng của cây, thường chọn mô non ( ít chuyên hoá – ñỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ ) Ví dụ chọn mẫu nuôi cấy : Măng tây : chồi ngọn ( Kohler, 1975 ) Khoai tây : mầm ( Morel, 1952 ) Dứa : chồi nách, chồi ñỉnh ( Paunethier, 1976 ) Bắp cải : mảnh lá ( Bimomilo, 1975 ) Suplơ : hoa tự ( Kholer, 1978 ) Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi ñưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử trùng ñểloại bỏ những vi sinh vật ( nấm, khuẩn ) bám trên mặt phẳng mẫu cấy. Chọn ñúng phương phápkhử trùng sẽ ñưa lại tỷ suất sống cao và chọn thiên nhiên và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ ñạt ñượctốc ñộ sinh trưởng nhanh. Thường dùng những chất : HgCl0, 1 % giải quyết và xử lý trong 5-10 phút, NaOCl hoặc Ca ( OCl ) 5-7 % giải quyết và xử lý trong 15-20 phút, hoặc H, dung dịch BrMột số dạng môi trường tự nhiên dinh dưỡng phổ cập : Muối khoáng : theo White ( 1943 ), Heller ( 1953 ), Murashige và Skoog ( 1962 ) Chất hữu cơ : ñường sarcarozaVitamin : B, B6, inositol, nicotin axitHocmon : auxin ( IAA, IBA, NAA, 2,4 D ) ; Xytokinin ( BA, BA, Kin, 2P ) ; Gibberelin ( GA3 ) • Giai ñoạn 2 : Nhân nhanhMục ñích giai ñoạn này là kích thích sự phát sinh số lượng lớn chồi trên một ñơn vị mẫucấy trong một thời hạn nhất ñịnh. Ðơn vị mẫu cấy hoàn toàn có thể tính theo số chồi cấy ban ñầu, sốñốt cấy ban ñầu, số protocom ban ñầu Tức là ñạt thông số nhân giống lớn nhất. Vật liệu khởi ñầu in vitro ñược chuyển sang môi trường tự nhiên nhân nhanh có bổ trợ chấtñiều tiết sinh trưởng nhóm xytokinin ñể tái sinh từ một chồi thành nhiều chồi. Hệ số nhânphụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm. Ở giai ñoạn này cần ñảm bảo một trong những nhu yếu : – Phát triển chồi nách – Tạo chồi bất ñịnh ( cụm chồi ) – Tạo phôi vô tínhKết quả giai ñoạn này phụ thuộc vào nhiều vào việc sử dụng những tác nhân kích thích sự phânhoá cơ quan mà ñặc biệt là phân hoá chồi như nhóm chất xytokinin và tăng cường ánh sángcả về thời hạn và cường ñộ ( 16 h và 2000 lux ), ánh sáng tím là thành phần quan trọng ñểkích thích phân hoá chồi ( weiss và Jaffe, 1969 ) Trường ðại học Nông nghiệp TP.HN – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng … … … … … … … … …. 24 * Sự tăng trưởng của chồi nách ñược kích thích bằng cách vô hiệu lợi thế ngọn khi nuôicấy những ñỉnh chồi và ñoạn thân mang mắt ngủ. Theo phương pháp này sự tăng trưởng chồidiễn ra theo hai cách : – Cắt ñoạn thân : cây tăng trưởng trực tiếp từ chồi ñỉnh hoặc chồi nách. Thường áp dụngcho nuôi cấy loại cây hai lá mầm như thuốc lá, khoai tây, hoa cúc-Tách chồi : tạo cụm chồi từ chồi ñỉnh hoặc chồi nách. Thường vận dụng cho loại cây 1 lá mầm như chuối, mía, lúa, lily, ñồng tiền, layơn – Tạo củ in vitro : củ ñược hình thành từ cây in vitro trong thiên nhiên và môi trường và ñiều kiện phùhợp cho sự ra củ. Thường sử dụng ñối với cây nhân giống bằng củ như khoai tây, khoailang, cây họ hành tỏi * Tạo chồi bất ñịnh ( adventitiou shoots ) : trong trường hợp này cần phải triển khai quátrình phản phân hoá và tái phân hoá ñể bắt những tế bào soma hình thành chồi trực tiếp hoặcgián tiếp trải qua giai ñoạn tăng trưởng mô seo. Ở những ñối tượng một lá mầm như lan, dứa, chuối, hoa loa kèn thường gặp sự phát triểncây qua giai ñoạn dẻ hành ( protocorm ) : từ mẫu cấy tạo thành hàng loạt protocorm, từ ñó, hoặc liên tục sản sinh protocorm mới hoặc tăng trưởng thành cây. * Tạo phôi vô tính ( somatic embryos : tương tự như như tạo chồi bất ñịnh, ñể tạo phôi vôtính cũng cần phải triển khai quy trình phản phân hoá và tái phân hoá tế bào ñể tế bàosoma hình thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp trải qua giai ñoạn tăng trưởng mô sẹo. Phôivô tính có cấu trúc lưỡng cực gồm có cả chồi mầm và rễ mầmCác phôi vô tính hoàn toàn có thể tái sinh thành cây hoàn hảo hoặc sử dụng làm nguyên vật liệu sảnxuất hạt giống tự tạo. * Tạo củ in vitro ( Microtuber ) : ñối với một số ít loại cây như khoai tây, khoai lang, hoaloa kèn ngoài giải pháp nhân giống bằng cây in vitro thì người ta còn nhân giốngbằng tạo củ in vitro. Với giải pháp tạo củ in vitro, giai ñoạn ñầu mọi thao tác tươngtrước như kỹ thuật nhân cây in vitro, ñến khi cây ñạt trạng thái sinh trưởng tốt thì ñượcchuyển sang môi trường tự nhiên ra củ, sau một thời hạn khoảng chừng từ 2-3 tháng ñể củ già sinh lý thìthu hoạch, củ thu ñược có size nhỏ nhưng trọn vẹn sạch bệnh. • Giai ñoạn 3 : Tạo cây hoàn hảo và giảng dạy cây con. Kết thúc giai ñoạn nhân cây tất cả chúng ta có ñược số lượng lớn chồi nhưng chưa hình thànhcây hoàn hảo vì chưa có bộ rễ cây. Vì vậy, cần chuyển chồi từ thiên nhiên và môi trường nhân nhanh sangmôi trường tạo rễ. Tách những chồi riêng cấy chuyển vào thiên nhiên và môi trường nuôi cấy có bổ trợ chấtñiều tiết sinh trưởng nhóm auxin. Mỗi chồi khi ra rễ là thành một cây hoàn hảo. Một số loại cây hoàn toàn có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường tự nhiên nhân nhanh giàuxytokinin sang môi trường tự nhiên không chứa chất ñiều tiết sinh trưởng. Ðối với những phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên thiên nhiên và môi trường không có chất ñiều tiết sinh trưởnghoặc môi trường tự nhiên có chứa xytokinin nồng ñộ thấp thì phôi sẽ tăng trưởng thành cây hoàn hảo. Khi ñã có cây in vitro hoàn hảo ñầy ñủ những cơ quan như thân, rễ, lá thì trước khi ñưara ngoài ñiều kiện tự nhiên cần có giai ñoạn đào tạo và giảng dạy cây ñể thích nghi với những thayñổi về nhiệt ñộ, ẩm ñộ, sự mất nước, sâu bệnh ñể chuyển trạng thái cây từ dị dưỡng sangtự dưỡng. Hình từ 23.1 ñến 28.1. Minh hoạ những hình thức nhân giống vô tính cây và củ in vitro ( nguồn : bộ môn Sinh lý thực vật – ðHNNI và website www.ars.usda.gov )

Source: https://mindovermetal.org
Category: Ứng dụng hay