Ứng dụng kỹ thuật sắc ký trong nghiên cứu hóa sinh

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (641.37 KB, 53 trang )

Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT
SẮC KÝ TRONG NGHIÊN
CỨU HÓA SINH
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
MỤC LỤC
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
MỞ ĐẦU
Các tế bào sống chứa hàng trăm loại hợp chất hóa học khác nhau. Các hợp
chất này bao gồm những đại phân tử như protein, acid nucleic, lipid,… cũng như
các hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ. Những hợp chất trên có thể hiện diện ở số
lượng nhỏ, dưới dạng vết (enzyme) hay ở số lượng nhiều (các protein cấu tạo).
Người ta muốn biết các thành phần hóa học của tế bào, nhằm hiểu rõ các quy trình
biến đổi căn bản của nó, qua đó giúp cuộc sống ngày càng thêm tốt đẹp. Muốn vậy,
người ta phải tìm cách tách các tách riêng chúng để xác định cấu trúc hóa học.
Từ đó, kỹ thuật tách riêng các hợp chất ra đời với tên gọi sắc ký
(chromatography). Ngày nay, sắc ký đã được sử dụng để tách tất cả các hợp chất dù
có màu hay không, dù trọng lượng phân tử nhỏ hay lớn.
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
NỘI DUNG
1. Tổng quan về kỹ thuật sắc ký
1.1. Lịch sử sắc ký
Năm 1903, nhà bác học Nga Michael Tswett đã cho dung dịch các sắc tố thực
vật trong ete dầu hoả lên cột nhồi bột mịn canxi cacbonat, ông thấy các sắc tố bị hấp

phụ lên trên đầu cột. Khi cho ete dầu hoả lên cột, các sắc tố di chuyển trong cột từ
trên xuống dưới, mỗi sắc tố có một tốc độ riêng, tách thành những vùng hay vòng
màu xếp chồng lên nhau, hình thành một hệ mà Tvest gọi đó là sắc đồ. Ông đặt tên
cho phương pháp tách này là sắc ký (Chromatography). Trong tiếng Hy
Lạp,“chroma” có nghĩa là chất màu, graphein có nghĩa là viết. Tên gọi này ngày
nay vẫn được sử dụng mặc dù phương pháp này còn được dùng tách các chất không
màu.
Đến thập kỷ 1930-1940, phương pháp này được phát triển nhanh chóng với
nhiều kỹ thuật khác nhau như sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc
ký ái lực.
Năm 1954, Mould D.L phát triển sắc ký gel để tách các hợp chất mang điện
tích theo trọng lượng phân tử của chúng. Đến năm 1964, Moor gọi là “gel
permeation chromatography” hay gọi là sắc ký lọc gel.
Năm 1906, sắc ký khí được biết đến nhưng đến 1952, kỹ thuật này mới phát
triển mạnh mẽ, nhất là trong thập niên 1960.
Năm 1967, Horvath C. là tác giả tạo máy sắc ký lỏng cao áp.
1.2.Định nghĩa sắc ký
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dừng để tách các thành phần của
một hỗn hợp. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất
khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau: một pha tĩnh và
một pha động (Trong thí nghiệm của Tvest: pha tĩnh là canxi cacbonat, pha động là
ete dầu hoả). Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu. Khi các
thành phần này di chuyển qua hệ thống sắc ký với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được
tách khỏi nhau theo thời gian. Mỗi một thành phần đi qua hệ thống trong một
khoảng thời gian riêng biệt, gọi là thời gian lưu. Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp
được chuyên chở trong chất lỏng hoặc khí và các thành phần của nó được tách ra do
sự phân bố khác pha nhau của các chất hòa tan khi chúng chảy qua pha tĩnh rắn

hoặc lỏng. Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được dùng để phân tích hợp chất phức tạp
dựa trên ái tính khác nhau của các chất trong môi trường động khí hoặc lỏng và đối
với môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua như giấy, gelatin hay gel
magnesium silicate,
Sắc ký là phương pháp để phân tách và tinh sạch các phân tử sinh học. Sắc ký
là phương pháp nhanh, dễ dàng và không ảnh hưởng đến protein, đây là phương
pháp được đề nghị trong nghiên cứu định lượng protein hay các phân tử.
Các giai đoạn của quá trình sắc ký:
Quá trình sắc ký gồm 3 giai đoạn chính:
a) Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh (ví dụ: đưa dung dịch các sắc tố lên đầu cột canxi
cacbonat). Các chất được giữ trên pha tĩnh.
b) Cho pha động chạy qua pha tĩnh (dung môi để dầu hoả qua cột), pha động sẽ
kéo theo các chất di chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau và
có vị trí khác nhau trên pha tĩnh tạo thành sắc ký đồ (chromatogram). Giai đoạn
này gọi là khai triển sắc ký. Nếu tiếp tục cho pha động chạy qua thì các chất có thể
lần lượt bị kéo ra ngoài pha tĩnh (ví dụ: ra khỏi cột). Đó là quá trình rửa giải và
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
dung môi dùng được và dung môi rửa giải (eluent), dịch hứng được ờ cuối cột gọi
là dịch rửa giải (eluate). Nếu các chất được tách trên pha tĩnh (sắc ký khai thêm ta
có thể lấy từng phần pha tĩnh có mang chất (phân đoạn bột trên cột) đem chiết lấy
chất. Nếu các chất được tách ra ngoài pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta có thể hứng thu
lấy các phân đoạn dịch rửa giải có các chất cần phân tích.
c) Phát hiện các chất: Các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất không màu
có thể phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng các thuốc thử. Trong sắc ký rửa giải có
thể phát hiện các chất khi chúng đi ra khỏi cột bằng cách cho dung dịch rửa giải đi
qua một bộ phận phát hiện gọi là detector đặt sau cột.
1.3. Phân loại các phương pháp sắc ký
1.3.1. Theo bản chất vật lý các pha

Pha động có thể là một chất lỏng hay chất khí
Pha tĩnh có thể là một chất rắn (hạt xốp hay bột mắn) hay một chất lỏng (được giữ
trên một chất mang rắn).
Do đó, dựa vào bản chất các pha ta phân biệt các phương pháp (trong tên của
phương pháp, pha động được nêu trước pha tĩnh):
• Sắc ký lỏng – lỏng (liquid – liquid chromatography LLC)
• Sắc ký lỏng – rắn (liquid – song chromatography LSC)
• Sắc ký khí – lỏng (gas – liquid chromatography GLC)
• Sắc ký khí – rắn (gas – solid chromatography GSC)
1.3.2.Theo hiện tượng sắc ký
Sắc ký hấp phụ (absorption chromatography): pha tĩnh là một chất rắn có khả
năng hấp phụ, đó là các phương pháp sắc ký lỏng – rắn và khí – rắn.
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
Sắc ký phân bố (partition chromatography): pha tĩnh là chất lỏng không hoà
lẫn được với pha động, chất lỏng này được bao trên bề mặt của một chất rắn gọi là
giá hay chất mang và phải là chất trơ, không tham gia vào sắc ký. Sắc ký phân bố
bao gồm sắc ký lỏng – lỏng và sắc ký khí – lỏng.
Sắc ký trao đổi ion (ion – exchange chromatography): pha tĩnh là chất nhựa
trao đổi ion chớp chất cao phân tử có mang những ion có khả năng trao đổi với các
ion cùng dấu của dung dịch hỗn hợp sắc ký).
Sắc ký theo loại cỡ (size – exclusion chromatography): còn gọi là sắc ký trên
gel. Các phân tử cỡ lớn sẽ được loạt các phân tử nhỏ hơn sẽ được tách theo kích
thước do các phân tử nhỏ di chuyển chậm hơn.
1.3.3.Theo kỹ thuật và phương tiện sắc ký
Phương pháp giữ pha tĩnh:
Sắc ký trên cột (column chromatography: CC) pha tĩnh được chứa trong một
cột bằng kim loại hay thuỷ tinh.
Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography: TLC): pha tĩnh được tráng đều

và giữ trên mặt phẳng của bản thuỷ tinh, nhựa hay nhôm. Lớp mỏng pha tĩnh
thường là: silicagel, nhôm oxit, cenlulose, chất nhựa trao đổi lớn và có chiều dày
khoảng 0,25 – 0,5mm.
Sắc ký giấy (paper chromatography – PC) pha tĩnh (lỏng) được thấm trên một
loại giấy lọc đặc biệt gọi là giấy sắc ký
Theo cách cho pha động chạy:
Sắc ký khai triển (development chromatography) cho pha động kép các chất
chạy và tách trên pha tĩnh (Sắc đồ nằm trên pha tĩnh).
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
Sắc ký rửa giải (elution chromatoglaphy) cho pha động chạy và kép các chất
lần lượt ra ngoài pha tính (ra khỏi cột, ra khỏi giấy).
Tốc độ di chuyển của một chất, peak và hình dáng peak
Tốc độ di chuyển của một chất
Tốc độ di chuyên của một chất có thể được đặc trưng bởi hệ số phân bố của nó
giữa hai pha hoặc bởi các đại lượng về sự lưu giữ của chất đó trên pha tĩnh (thời
gian lưu, thể tích lưu)
a. Thời gian lưu và thể tích lưu
Thời gian lưu là thời gian cần để một chất di chuyển qua cột sắc ký, khi ra
khỏi cột nhờ thiết bị detector ghi nhận tín hiệu và xuất hiện rực trên sắc đồ (tính từ
lúc bơm mẫu đến khi xuất hiện peak).
Tm là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ, nghĩa là tốc độ di chuyển
của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của dung môi, thời gian này được gọi là
thời gian chết. tR càng lớn, chất càng bị lưu giữ mạnh và tốc độ di chuyển của nó
càng nhỏ.
b. Hệ số phân bố
Trong đó: Cs và Cm là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động khi cân bằng
được thiết lập. Khi nồng độ nhỏ K phụ thuộc vào bản chất các pha, chất tan và nhiệt
độ K càng lớn thì chất đó phân bố càng nhiều trong pha tĩnh và di chuyển càng

chậm.
Peak và hình dáng peak
a. Hình dáng peak: Hình dáng lý tưởng của tức là lực đối xứng, nhưng thực tế lúc
sắc ký chỉ gần đối xứng. Chiều rộng của tục được đo ở 1/10 chiều cao của peak.
b. Sự kéo dài peak: là kết quả của sự di chuyển nhanh chậm khác nhau của các phân
tử của cùng một chất khi đi qua cột sắc khí. Các lực ra chậm bao giờ cũng tù hơn.
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
c. Hiệu lực của cột: Hiệu lực của cột thường được đo bằng hai thông số: số đĩa lý
thuyết N và chiều cao đĩa lý thuyết H. Ta có thể coi như cột sắc khí được chia thành
N lớp hay N tầng mỏng, ở mỗi một lớp sự phân bố chất tan vào hai pha đạt trạng
thái cân bằng. Những tầng mỏng giả định này được gọi là địa lý thuyết. Nếu cột sắc
khí có chiều dài là L thì: H = N/L. Cột có N lớn là cột có hiệu lực cao. 6
d. Độ phân giải: Độ phân giải Rs là tỉ số khoảng cách giữa hai peak và độ rộng
trung bình
của peak.
Rs = 0,75 hai pic tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều;
Rs = 1,0 hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%;
Rs = l,5 hai pic tách hoàn toàn (chi xen phủ 0,3%).
2. Các kỹ thuật sắc ký
2.1.Sắc ký giấy
Sắc ký giấy là một phương pháp phân tách dễ dàng các thành phần của một
hỗn hợp (acid amin). Trong sắc ký giấy, pha tĩnh là một tờ giấy bằng cellulose ( thí
dụ như tờ giấy thấm, giấy lọc trong phòng thí nghiệm). Các lọai giấy này có tính ái
nước nên trên thực tế, pha tĩnh là một lớp nước (H2O) thật mỏng đã được che phủ
lên trên bề mặt của tờ giấy, chính vì thế sắc ký giấy là lọai sắc ký phân chia. Pha
động là chất lỏng( có thể là chất lỏng hay một hỗn hợp dung môi).
Phương pháp này thường được sử dụng để tách các chất ưa nước như amino
acid, đường, Trong giấy, cellulose có dạng sợi, các sợi này khi nằm cạnh nhau sẽ

tạo thành mạng lưới với các lỗ rỗng to. Khi ly giải, dung môi di chuyển dọc theo bề
mặt sợi và các lỗ rỗng sẽ được phủ đầy dung môi. Như thế, các chất tan bị phân tán
nhiều trong lỗ rỗng khiến các vết sắc ký to hơn. Bột giấy hấp thu nước, nước bị giữ
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
lại trong cấu trúc glucopyranose bằng cầu nối hydrogen, vì thế quá trình sắc ký xảy
ra theo cơ chế phân chia.
Hình: Sắc ký giấy, các chất màu di chuyển theo dung môi lên giấy với các
điểm khác nhau.
(a) Một giọt hỗn hợp (drop of mixture) đặt ở một góc mảnh giấy lọc, một cạnh giấy
nằm trong dung môi.
(b) Dung môi di chuyển lên tấm giấy bằng lực hút mao mạch, các chất sẽ phân bố
theo các tỷ lệ khác nhau Mỗi hợp chất di chuyển với tốc độ phản ánh kích thước
của phân tử của nó và hòa tan của nó trong dung môi.
(c) Những chất khác nhau sẽ được trải ra ở những điểm khác biệt trên bảng, tạo
thành một sắc ký đồ.
Hiện nay, sắc ký giấy đang dần được thay thế bằng sắc ký lớp mỏng. Do phần
lớn các chất hữu cơ không có màu, nên sắc ký giấy sẽ không cho thấy được vị trí
của mẫu chất trong quá trình dung môi di chuyển đi lên giấy.
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
Nhược điểm sắc ký giấy: Trong giấy, cellulose ở dạng những sợi dài nằm song
song kề nhau một cách tự nhiên, và một hệ thống mạng như thế chắc chắn có các lỗ
hỗng. Khi dung môi giải ly di chuyển (mang theo các chất tan, solute) dọc theo bề
mặt của sợi, các lỗ rỗng này sẽ được dịp phủ đầy dung môi, và các chất tan có dịp
khuếch tán vào các lỗ rỗng này, khiến các chất tan càng lúc càng to dần so với vết
chấm tạo mức xuất phát ban đầu. Còn nếu sợi cellulose được nén chặt quá dòng
chảy sẽ rất khó di chuyển.

2.2.Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng là hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa
chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các
dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ như: silicagel
hay oxid alumin). Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng
như tấm kiếng, tấm nhôm hay tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một
lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng.
Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy.
Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm của một loại hợp chất hấp thu
(silicagel, alumin, ) được tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên tấm kiếng, tấm
nhôm, hay tấm plastic. Chất hấp thu trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột
hay một lọai polymer hữu cơ.
Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác
nhau. Sử dụng khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5%, nhờ một vi
quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phái trên cao hơn một
chút so với mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình.
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
Hình: Bình sắc ký lớp mỏng
Pha động: dung môi hay hỗn hợp 2 dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo
tấm lớp mỏng, và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển càng cao nhờ
tính mao quản.
Mỗi thành phần chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của
dung môi.
Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh
muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy thuộc vào độ hòa tan của mẫu chất
trong dung môi.
Ưu điểm:
-Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích

-Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân
tích.
-Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp
mỏng.
Các bước thực hiện sắc ký lớp mỏng:
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
-Chuẩn bị ống vi quản: ống thủy tinh có đường kính trong ống nhỏ, khỏang 1-
2mm, một đầu được vót nhọn, dài 10-20cm. Sử dụng ống vi quản để chấm nhiều
lọai mẫu dung dịch khác nhau, chỉ cần sau mỗi lần sử dụng, rửa sạch vi quản bằng
dung môi hữu cơ như aceton.
-Chuẩn bị tấm bản mỏng: tấm bản mỏng thương mại 20x20cm, dùng kéo cắt
bản với kiách thước cần thiết, tấm bản phải vừa bình giải ly. Dùng bút chì vạch nhẹ
nét xuất phát và mức tiền tuyến dung môi.
-Chuẩn bị dung dịch mẫu: Mẫu là chất lỏng, có thể chấm trực tiếp mẫu lên bản
mỏng, còn mẫu là dung dịch quá sễt, có thể pha loãng mẫu. Với mẫu là chất rắn
phải hòa tan trong dung môi hữu cơ phù hợp, nồng độ 2-5%. Nhờ một vi quản để
dung dịch mẫu lên bề mặt tấm sắc ký lớp mỏng một cách thận trọng, tránh không
cho làm lũng bề mặt của lớp mỏng. Mỗi vết chấm trên bản không chứa nhiều hơn
12ug (10ug là tối ưu) mẫu chất.
-Sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm, rồi nhúng bản vào dung dịch giải
ly
-Giải ly để dung môi giải ly di chuyển lên: Sau khi bình đã bão hòa dung môi,
người ta đặt tấm mỏng vào bình khai triển để cho các vết chấm mẫu ở bờ cạnh phía
dưới đáy bình. Cạnh đáy của tấm lớp mỏng nậgp trong dung môi giải ly khỏang
0.5-1cm. Các vết mẫu không được ngập trong dung môi giải ly, vì như thế dung
môi sẽ khuếch tán vào trong dung môi.
-Hiện hình các vết sau khi giải ly: Các hợp chất có màu sẽ được nhìn thấy
bằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu

muốn nhìn thấy các vết, cần sử dụng phuơng pháp vật lý (Phát hiện bằng tia tử
ngoại UV: đèn chiếu tia UV 254nm ánh sáng này nhận ra các hợp chất có thể hấp
thu tia UV, các hợp chất có màu tối sẫm trên nền sáng; đèn chiếu tia UV 366nm ánh
sàng này phát hiện nhữgn hợp chất có phát huỳnh quang, các vết sẫm của chất mẫu
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
có màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu) hay dùng phương pháp hóa học (Bằng
cách dung thuốc thử hiện hình như hơi iod, 2,7-fluorescein phát hiện đa số hợp chất
hữu cơ, ninhydrin phát hiện aminoacid hay amin, 2,4-dinitrophenylhydrazin phát
hiện aldehyde hay caton, clorur antimony phát hiện steroid hay vitamin hay
carotenoid,…)
– Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di
chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng
dịch chuyển của dung môi:
Trong đó:
a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm.
b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của
vết, tính bằng cm.
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l.
Hình: Các bước của quá trình sắc ký lớp mỏng
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
2.3.Sắc ký cột:
Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh là những hạt
có kích thước tương đối lớn (50-150um), được nạp trong cột thủy tinh. Mẫu chất
cần phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh che chở
để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phái trên cao.
Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặ

ngay ống dẫn ra của cột. Phương pháp này thường làm cho quá trình tách bị chậm,
hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Tuy vậy, sắc ký cột cũng có ưu
điểm là pha tĩnh và các dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng
mẫu tương đối lớn.
Các bước thực hiện sắc ký cột:
-Lựa chọn chất hấp thu :pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phân
cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau. Vơí 2 phân tử
không phân cực, phân tử naò có trọng luợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh
hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột chậm hơn
so với các phân tử nhỏ, và cũng có khi nó ở lại lâu hơn trong cột so với phân tử tuy
có tính phân cực.
– Lựa chọn dung môi:Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan hoàn toàn trong dung môi
phù hợp với nồng độ 10mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A). Chuẩn bị 4-6 tấm bản
mỏng 2,5x10cm. Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng 2-5ul dd(A). Mỗi
bản mỏng được triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế đó phát hiện
bằng đèn UV hay thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào
phù hợp. Từ kết quả đó, cố gắng tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi
phân cực và một dung môi kém phân cực thí dụ như ete dầu hỏa: etyl acetate.
-Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá,
cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao cột. Cho chất hấp
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
thu dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa khỏ
nhẹ vào thành cột. Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao khoảng 2cm trong cột,
thì mở nhẹ khoá ở bên dưới để cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher
trống để bên dưới cột, dung môi này dẽ được rót lại lên đầu cột. Sau khi nạp xong,
cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi chất hấp thu trong cột đồng
nhất.
-Nạp mẫu: Mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký. Nếu mẫu ở dạng

rắn thì hoà tan mẫu chất vào trong một lượng nhỏ dung môi, loại dung môi cho khởi
đầu sắc ký. Thực hiện nạp mẫu lên cột như sau:
+Mở khoá cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cột
xuống sao cho vừa sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột.
+Đóng khoá lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột. Muốn nạp mẫu, sử dụng một
pipet hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu pipet gần sát mặt thoáng cảu chất hấp thu
trong cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành cột cho dung dịch chảy ra theo
thành trong của cột, chạm xuống bề mặt chất hấp thu.
+Mở khoá bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu
được thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột, cần canh chừng không cho chất hấp
thu đầu cột bị khô.
+Dùng pipet cho một luợng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, đồng thời dùng
dung môi này để rửa sạch ống mà dung dịch dính trên thành cột.
+Mở khoá cho dung môi chảy ra. Lặp laị vài lần giúp cho dung dịch mẫu thấm
sâu vào chất hấp thu, dung môi trong suốt không lây màu của chất mẫu.
+Sử dụng bông thủy tinh, bông gòn, cát hay giấy lọc đặt nhẹ lên mặt thoáng
chất hấp thu để bảo vệ mặt cột.
+Cho dung môi vào đầy cột để tiến hành giải ly trên cột.
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
2.4. Sắc ký trao đổi ion
Sự trao đổi ion là sự gắn kết có tính chất thuận nghịch giữa các phân tử có
mang điện tích. Trong sắc ký cột nhồi, pha tĩnh R có gắn thêm nhóm chức G mang
điện tích. Giả sử cho đi ngang qua cột một hỗn hợp mẫu chất ban đầu có chứa nhiều
lọai chất tan (solute) khác nhau, chất tan nào có mang điện tích ngược dấu với điện
tích của nhóm chức, thí dụ chất tan S, chất tan dễ đuổi đối ion C ra thế chỗ vào, để
gắn vào pha tĩnh, và như thế chất tan sẽ bị giữ lại trong cột, trong khi đó những chất
khác của hỗn hợp mẫu chất ban đầu sẽ không bị giữ lại nên đi ra khỏi cột. kỹ thuật
này tách riêng được hợp chất S ra khỏi hỗn hợp ban đầu.

RG- + S+ Æ RG-S+ + C+
Hoặc RG+ +S- Æ RG+S- + C-
Trong đó: R là pha tĩnh hay gọi là nhựa (resin), G là nhóm chức mang điện
tích được cố định trên pha tĩnh hay còn gọi là nhóm chức họat động của nhựa. C là
đối ion của G. S là chất hữu cơ có mang điện tích trái dấu với G.
Các loại hạt nhựa trao đổi ion: nhựa polystyren, silicagel, polymer
carbohydrate.
Các bước trong sắc ký trao đổi ion:
-Nhồi nhựa trao đổi ion vào cột: Giữ cột thẳng đứng trên giá, khóa vòi bên
dưới cột. Nhựa trao đổi ion đã đã được cân bằng trong dung dịch đệm, lượng nhựa
và thể tích dung môi sao cho có thể rót nhựa dễ dàng vào cột, không tạo ra những
bọt khí nằm giữ các hạt nhực. Để yên 5-10 phút cho các hạt nhựa lắng xuống, rót
đầy cột bằng dung dịch đệm, mở khóa để cho hạt nhựa lắng xuống. Khi nhồi cột
hoàn tất, cần cân bằng cột bằng chách cho dung dịch đệm chày qua cột, cuối cùng
kiểm tra pH của dung dịch chảy ra khỏi cột.
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
-Nạp mẫu chất lên đầu cột: dung dịch mẫu được lọc trong suốt trước khi nạp
vào cỗt, lọc bằng tờ giấy lọc hay ngang qua một lớp celite. Lượng mẫu tùy vào
lượng nhựa cũng như khả năng trao đổi của nhựa. Đầiu quan trọng nhất là làm sao
để cho tất cả các cấu tử quan trọng của mẫu chất được hấp thu hết vào nhựa, tức là
chú ý số lượng mẫu hơn là thể tích của mẫu. Để nạp mẫu lên cột: mở khóa để hạ
mức dung dịch đệm xuống vừa sát mức nhựa ở trên đầu cột, khóa lại. dùng pipet
hút và đặt dung dịch mẫu lên đầu cột, mở khóa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựa
ở trên đầu cột. Để yên 10-20 phút để cho mẫu chất tiếp xúc cân bằng với nhựa.
-Khi tất cả mẫu đã được gắn lên đầu cột nhựa, cho vài ml dung dịch đệm ban
đầu chảy qua, nối cột với bình cung cấp dung dich giải ly.
-Giải ly bằng cách tắng dần nồng độ dung dịch giải ly: hỗn hợp mẫu đang gắn
vào nhựa trao đổi ion trong dung dịch đệm có nồng độ thấp. Để có thể tách mẫu

chất ra khỏi nhựa thường, cần phải gia tăng lực ion của dung dịch đệm bằng cách
cho thêm NaCl. Khi có thêm NaCl trong dung dịch đệm, ion của dung dịch đệm sẽ
cạnh tranh với hỗn hợp mẫu chất, để giành lấy những nhóm chức họat động cảu
nhựa, đẩy hợp chất ra khỏi nhựa, rồi theo dòng chảy đi ra khỏi cột.
Trong phương pháp sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một
điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang
điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột
carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion
dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu
hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)),
gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế,
những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu
bị giữ lại cột.
Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những
ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch
tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do
đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo
độ lớn về điện tích.
2.5.Sắc ký gel
Trong sắc ký gel, pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng và các lỗ rỗng này
được phủ đầy dung môi dùng làm pha động. Một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất có
trọng lượng phân tử khác nhau cò thể tách riêng được hay không là tuỳ vào kích
thước lỗ rỗng. Các phân tử có kích thước lớn hơn lỗ rỗng, không thể chui lọt vào
bên trong lỗ rỗng, nhanh chóng theo dòng chảy của pha động đi ra khỏi cột. các
phân tử có trọng lượng phân tử (TLPT) nhỏ hơn kích thước lỗ rỗng, sẽ toàn phần
hay bán phần lọt vào lỗ rỗng, tuy rằng cuối cùng rồi cũng theo dòng chảy đi ra khỏi

cột nhưng sẽ chậm trễ hơn. Dòng chảy pha động khiến các phân tử lớn không thể
chui vào lỗ rỗng của mạng gel, nhanh chóng đi xuyên qua cột, ra khỏi cột, trong khi
phân tử nhỏ ra khỏi cột lâu hơn vì còn chui vào và đi ra khỏi lỗ rỗng của gel. Như
vậy, các thành phần khác nhau của hỗn hợp mẫu khi đi ngang qua cột sắc ký gel, sẽ
ra khỏi cột lần lượt theo trình tự TLPT lớn đi ra khỏi cột trước, phân tử nhỏ đi ra
khỏi cột sau.
Sắc ký gel phải thực hiện trong cột hình ống trụ bằng thuỷ tinh, gồm các bước
sau:
Nhồi gel vào cột: các hạt gel trương nở hiện diện ở dạng huyền phù trong
dung môi phù hợp cho vào cột. Huyền phù được chỉnh sao cho thật sệt nhưng khi
rót vẫn chảy vào cột thành dòng dễ dàng. Cân bằng cột bằng cách cho dung môi
giải ly chảy ngang qua cột, lượng dung môi có thể tích bằng 2-3 lần thể tích cột.
Kiểm tra sự chặt chẽ của cột bằng cách cho một lượng mẫu thử vào đầu cột. mẫu
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
thử thường được chọn là dextran blue 2000, có màu xanh dương để có thể được
quan sát bằng mắt thường sự di chuyển của mẫu trong cột.
Đặt mẫu cần sắc ký lên đầu cột gel: dung dịch mẫu cần phân tách phải được
lọc bỏ những hợp chất còn ở dạng rắn, cặn. Dung dịch mẫu hoà tan vào dung dịch
đệm, đặt lên đầu cột giống như sắc ký cột.
Triển khai sắc ký gel: triển khai giải ly rất đơn giản, chỉ sử dụng kỹ thuật dung
môi đơn nồng độ (nghĩa là sử dụng một loại dung môi hay hỗn hợp hai dung môi,
khi bắt đầu cho tới khi kết thúc quá trình giải ly chỉ sứ dụng một loại dung môi đó).
giải lycó thể bằng trọng lực nhưng rất tốt khi sử dụng bơm đẩy từ đầu cột. hứng
dung môi giải ly trong những lọ nhỏ, mỗi lọ có một thể tích nhất định. Các chất tan
sẽ ra khỏi cột theo thứ tự TLPT giảm dần.
Ứng dụng: kỹ thuật này dùng để tách các đại phân tử có nguồn gốc sinh học
như: protein, polysaccharide, acid nuleic, enzyme, Người ta ứng dụng vào việc
đóan TLPT của một hợp chất chưa biết.

2.6. Sắc ký ái lực
Sắc ký ái lực hấp thụ phát hiện các ái lực sinh học mà một phân tử sinh học có
với một phân tử khác được cố định trên một pha ổn định. Có nhiều phương pháp
để rửa giải các phân tử ái lực vì có nhiều loại sắc ký ái lực khác nhau, các bước theo
gradient vẫn thường được sử dụng. Thường sử dụng trên các hệ thống có áp suất
thấp. Các giá thể (thường là agarose) thường chịu được áp suất dưới 50psi.
Nhược điểm: đắt tiền, khó tẩy rửa, chọn lọc ligand (phối tử), gắn kết ligand
lên giá thể hoạt hóa thường gặp nhiều khó khăn.
Ưu điểm: phát triển phương pháp tinh sạch trên protein A (protein A là
antigen cho IgG), bước bắt giữ tốt, cho phép phân tách protein dạng nguyên thủy
còn họat tính với dạng biến tính.
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
Sử dụng sắc ký ái lực cho tương tác giữa kháng nguyên kháng thể: ta có thể
tinh sạch một kháng nguyên bằng cách cho mẫu đi qua cột có chứa giá thể liên kết
với kháng thể để thu nhận protein. Ngược lại, một giá thể có liên kết với một kháng
nguyên chuyên biệt sẽ bắt giữ kháng thể chuyên biệt cho kháng nguyên đó. Ứng
dụng nhiều nhất là gắn kết protein A vào gel để gắn kết với các globulin miễn dịch.
2.7. Sắc ký tương tác kỵ nước
Sắc ký tương tác kỵ nước là phuơng pháp bổ sung khá tốt cho các kỹ thuật
phân tách khác. Trong những năm gần đây, phương pháp này trở nên thông dụng
như là bước đầu tiên trong quá trình sắc ký.
Loại hạt Macro-Prep có dẫn xuất là nhóm kỵ nước, có thể là gốc methyl hay t-
butyl. Các gốc này hấp dẫn các gốc kỵ nước khác có trên bề mặt protein. Khi cho
mẫu protein vào trong điều kiện nồng độ muối cao ép các phần kỵ nước lại gần
nhau và đính với nhau. Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách giảm dần nồng
độ muối cho đến khi các phần kỵ nước đi lại vào trong dung dịch.
Đặc điểm: Phân tách các phân tử theo tính kỵ nước của phân tử. Các nhóm kỵ
nước khác nhau đựợc cố đinh trên bề mặt giá thể. Dưới điều kiện nồng độ muối cao

(thấp) các phần kỵ nước trên
phân tử tương tác các nhóm cố định. Các phân tử gắn kết được rứa giải bằng
cách giảm áp lực ion và vì vậy hòa tan các phân tử ra khỏi giá thể.
Ưu điểm: Là bước cho phép cô mẫu, công suất cao, nhanh, mẫu được thu nhận
trong nồng độ muối thấp.
Nhược điểm: một số protein có thể bị tủa ở nồng độ muối cao, khó nâng cấp
quy mô lớn.
2.8. Sắc ký khí
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
Sắc ký khí là phương pháp được dùng để tách các chất ở thể khí bay hơi, với
pha động là chất khí, gọi là khí mang (carrier gas). Sắc ký khí còn áp dụng cho các
chất khí, lỏng, rắn dễ bay hơi và bền nhiệt độ cao, có TLPT M<500.
Sắc ký khí rắn (GSC – gas solid chromatography): pha tĩnh rắn là một chất hấp
phụ, đây là sắc ký khí hấp phụ và sắc ký khí lỏng (GLC – gas liquid
chromatography): pha tĩnh lỏng được bao hay gắn trên một chất mang rắn (solid
support) đây là sắc ký khí phân bố.
Sử dụng phương pháp sắc ký khí có khả năng tách được hoàn toàn những chất
hữu cơ tương tự, ví dụ như o-; m-; p-xilen không thể tách được bằng phương pháp
chưng cất phân đoạn nhưng tách được khá đơn giản bằng sắc ký khí, cũng như sử
dụng đề tách những hỗn hợp rất phức tạp như khí thải ô tô chứa trên 300 hợp chất.
Với việc ra đời của nhiều loại detector nhiều phương pháp mới xuất hiện như: sắc
ký khí – khối phổ (GS – MS), sắc ký khí – hồng ngoại (GC – IR) đã làm tăng khả
năng phân tích của sắc ký khí.

Hình: Sơ đồ của một máy sắc ký khí
1. Khí mang
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang

Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
Khí mang là một khí trơ như nhờ, hen, ngon, hidro trong đó hai là khí mang
phổ biến nhất. Khí được chứa trong bom khí có gắn van giảm áp và điều chỉnh. Khí
mang cần có độ tinh khiết cao và phải không tương tác với mẫu, chỉ mang mẫu đi
qua cột: Tín hiệu đetectơ có phụ thuộc vào sự khác nhau về tính chất giữa khí mang
vàchất cần phân tích.
2. Bộ bơm mẫu
Thường dùng bơm tiêm đề bơm trực tiếp mẫu qua một vách polime silicon
chịu nhiệt cao vào cột hoặc vào phòng đun nóng mẫu để mẫu lỏng có thể bay hơi
nhanh chóng. Yêu cầu cần 15 thiết là mẫu phải có đủ áp suất hơi để có thể được làm
bay hơi trong phòng mẫu. Nhiệt độ phòng mẫu có thể cao hơn nhiệt độ trong cột
một chút để quá trình bay hơi được thực hiện dễ dàng.
3. Cột sắc ký
Cột được đặt trong lò có thể điều chỉnh nhiệt độ trong quá trình thực hiện. Cột
thông dụng nhất trong phân tích là những ống bằng thép không rỉ (đồng, thép) hoặc
bằng thuỷ tinh dài từ 1 đến 10 m và có đường kính từ 2 đến 4 mm. Chúng được uốn
cuộn tròn cho khớp với phòng lò. Cột được nhồi bằng những phần tử rắn hoạt động
như một pha tĩnh (GSC): đó là những hạt nhỏ xếp gắn trên mặt trong cột hoặc pha
tĩnh được tẩm trên các hạt nhỏ đó. Trong sắc ký khí lỏng (GLC), pha tĩnh được giữ
trên chất mang, đó là những hạt chất rắn nhỏ, bền nhiệt, trơ về mặt hoá học, có lỗ cỡ
1 – 5 μm, bề mặt riêng lớn từ 1 – 10 m2/g. Pha tĩnh phải chịu nhiệt, hoá lỏng ở nhiệt
độ phân tích, trơ về hoá học. Thường hay sử dụng các polyme xốp hoặc gel
aluminosilicat khử nước.
4. Detector
Yêu cầu về detector rất nghiêm ngặt: Mọi hợp phần có trong 0,1 μl mẫu phải
được phát hiện ở mức 1% cho nên phải nhanh chóng phát hiện được 0,002 μl (có
khối lượng cỡ 10-6g) mẫu. Các detector hiện nay đo được những lượng nhỏ hơn
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký

Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
đến mấy bậc. Hiện nay trong phương pháp GC người ta sử dụng những loại detector
sau:
Detector dẫn nhiệt (TCD): Việc vận hành của detector dựa trên sự cân bằng
nhiệt cửa một dây dẫn nung nóng. Khi có chất cần phân tích đi qua thì độ dẫn điện
của hỗn hợp khí sẽ thấp đi, dây sẽ nóng lên, xuất hiện một tín hiệu điện. Detector
dẫn nhiệt thích hợp với nhiều chất cần phân tích.
Detector ion hoá ngọn lửa (FID): Khi đốt cháy các hợp chất hữu cơ trong ngọn
lửa, chúng sẽ tạo ra các ion. Các điện cực ở gần ngọn lửa sẽ phát hiện ra sự có mặt
của các ion bằng sự xuất hiện một dòng điện nhỏ chạy qua mạch điện. Có thể đo
được những dòng ngay cả khi chứng chỉ xấp xi bằng 10-12
2.9. Sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
– Áp dụng cho phân tích mẫu dạng lỏng, rắn có TLPT M>2000. – Các thành phần
chính của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
Bình chứa dung môi
Thường làm bằng thuỷ tinh, đôi khi làm bằng thép không rỉ, trong phương pháp rửa
giải thông thường chỉ cần một bình chứa dung môi, trong phương pháp rửa giải
gradient thường dùng 2, 3, 4 bình chứa các dung môi khác nhau và hệ dung môi rửa
giải là hỗn hợp của các loại dung môi trên trộn lẫn với nhau theo ti lệ đã được xác
định. Cần loại các hạt và các khí hoà tan trong dung môi.
Hệ thống bơm
Bơm dùng trong phương pháp phải tạo được áp suất cao (3000 – 6000 psi hay
khoảng 250 – 500at), lưu lượng bơm khoảng 0,1 đến 10 ml/ph, phải trơ với các
dung môi. Hệ thống bơm này phải có khả năng bơm pha động qua cột ở áp suất cao
mà không bị ngắt quãng hoặc tạo nhịp sóng có thể làm sai lệch các lực thu được. Có
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
Kỹ thuật sắc ký
Ứng dụng trong nghiên cứu và hóa sinh học
nhiều kiểu bơm đã dùng trong các máy HPLC; nhưng kiểu phông xoay chiều hiện
nay được dùng phổ biến nhất.

Hệ bơm mẫu (hệ tiêm mẫu)
Mẫu được bơm vào cột nhờ hệ thống van mẫu. Người ta bơm mẫu vào vòng mẫu
với thể tích thường là từ 10 đến 20 μl.
Cột sắc ký: Kiểu cột thường phụ thuộc vào phương pháp dùng để tách, nhưng
thường là những cột bằng thép không gỉ, có cỡ lỗ chính xác đường kính từ 3 đến 4
túm và dài từ 10 đến 30cm (những cột dùng cho SEC đường rộng hơn và dài đến
100cm). Loại cột này có hiệu lực rất cao, có số (ra lý thuyết lên đến 100.000 đĩa cho
1m chiều dài cột)
Detector : Là bộ phận phát hiện các chất khi chứng ra khỏi cột và ghi nhận các tín
hiệu ghi trên sắc ký đồ. Hiện đang sử dụng các loại detector sau: Detector tử ngoại
(UV): Dùng đèn thuỷ ngân cho vạch 254nm. Nhiều chất hấp thụ ở bước sóng này.
Detector tử ngoại và khả kiến (UV-VIS): Dùng phổ quang kế lựa chọn bước sóng từ
195 đến 750 nm. Loại này hiện nay được dùng nhiều nhất. Detector điện hoá và
detector huỳnh quang có độ nhạy và độ chọn lọc cao dùng trong phân tích vết.
Dùng detector điện hoá có thể phát hiện được những lượng picrogam (10-12g)
Các phương pháp sắc ký hiệu nâng cao
2.9.1. Sắc ký phân bố hiệu nâng cao
Gồm hai loại: Sắc khí lỏng – lỏng và sắc ký pha liên kết.
– Sắc ký lỏng – lỏng (LLC): Pha tĩnh là chất lỏng được bao trên bề mặt của các hạt
chất mang, tức là được hấp phụ trên chất mang.
– Sắc ký pha liên kết (BPC): Pha tĩnh được gắn hoá học với chất mang tạo ra liên
kết siloxan nối nhóm cơ – silic với silicagen.
HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang
phụ lên trên đầu cột. Khi cho ete dầu hoả lên cột, những sắc tố chuyển dời trong cột từtrên xuống dưới, mỗi sắc tố có một vận tốc riêng, tách thành những vùng hay vòngmàu xếp chồng lên nhau, hình thành một hệ mà Tvest gọi đó là sắc đồ. Ông đặt têncho phương pháp tách này là sắc ký ( Chromatography ). Trong tiếng HyLạp, “ chroma ” có nghĩa là chất màu, graphein có nghĩa là viết. Tên gọi này ngàynay vẫn được sử dụng mặc dầu phương pháp này còn được dùng tách những chất khôngmàu. Đến thập kỷ 1930 – 1940, phương pháp này được tăng trưởng nhanh gọn vớinhiều kỹ thuật khác nhau như sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng mảnh, sắc ký trao đổi ion, sắcký ái lực. Năm 1954, Mould D.L tăng trưởng sắc ký gel để tách những hợp chất mang điệntích theo khối lượng phân tử của chúng. Đến năm 1964, Moor gọi là “ gelpermeation chromatography ” hay gọi là sắc ký lọc gel. Năm 1906, sắc ký khí được biết đến nhưng đến 1952, kỹ thuật này mới pháttriển can đảm và mạnh mẽ, nhất là trong thập niên 1960. Năm 1967, Horvath C. là tác giả tạo máy sắc ký lỏng cao áp. 1.2. Định nghĩa sắc kýHVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong điều tra và nghiên cứu và hóa sinh họcSắc ký là một nhóm những phương pháp hoá lý dừng để tách những thành phần củamột hỗn hợp. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân loại khác nhau của những chấtkhác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau : một pha tĩnh vàmột pha động ( Trong thí nghiệm của Tvest : pha tĩnh là canxi cacbonat, pha động làete dầu hoả ). Pha tĩnh trì hoãn sự chuyển dời của những thành phần trong mẫu. Khi cácthành phần này chuyển dời qua mạng lưới hệ thống sắc ký với vận tốc khác nhau, chúng sẽ đượctách khỏi nhau theo thời hạn. Mỗi một thành phần đi qua mạng lưới hệ thống trong mộtkhoảng thời hạn riêng không liên quan gì đến nhau, gọi là thời hạn lưu. Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợpđược chuyên chở trong chất lỏng hoặc khí và những thành phần của nó được tách ra dosự phân bổ khác pha nhau của những chất hòa tan khi chúng chảy qua pha tĩnh rắnhoặc lỏng. Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được dùng để phân tích hợp chất phức tạpdựa trên ái tính khác nhau của những chất trong môi trường tự nhiên động khí hoặc lỏng và đốivới thiên nhiên và môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng chuyển dời qua như giấy, gelatin hay gelmagnesium silicate, Sắc ký là phương pháp để phân tách và tinh sạch những phân tử sinh học. Sắc kýlà phương pháp nhanh, thuận tiện và không tác động ảnh hưởng đến protein, đây là phươngpháp được đề xuất trong nghiên cứu và điều tra định lượng protein hay những phân tử. Các tiến trình của quy trình sắc ký : Quá trình sắc ký gồm 3 quá trình chính : a ) Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh ( ví dụ : đưa dung dịch những sắc tố lên đầu cột canxicacbonat ). Các chất được giữ trên pha tĩnh. b ) Cho pha động chạy qua pha tĩnh ( dung môi để dầu hoả qua cột ), pha động sẽkéo theo những chất chuyển dời trên pha tĩnh với vận tốc khác nhau, tách khỏi nhau vàcó vị trí khác nhau trên pha tĩnh tạo thành sắc ký đồ ( chromatogram ). Giai đoạnnày gọi là khai triển sắc ký. Nếu liên tục cho pha động chạy qua thì những chất có thểlần lượt bị kéo ra ngoài pha tĩnh ( ví dụ : ra khỏi cột ). Đó là quy trình rửa giải vàHVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong nghiên cứu và điều tra và hóa sinh họcdung môi dùng được và dung môi rửa giải ( eluent ), dịch hứng được ờ cuối cột gọilà dịch rửa giải ( eluate ). Nếu những chất được tách trên pha tĩnh ( sắc ký khai thêm tacó thể lấy từng phần pha tĩnh có mang chất ( phân đoạn bột trên cột ) đem chiết lấychất. Nếu những chất được tách ra ngoài pha tĩnh ( sắc ký rửa giải ) ta hoàn toàn có thể hứng thulấy những phân đoạn dịch rửa giải có những chất cần nghiên cứu và phân tích. c ) Phát hiện những chất : Các chất màu hoàn toàn có thể phát hiện thuận tiện, những chất không màucó thể phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng những thuốc thử. Trong sắc ký rửa giải cóthể phát hiện những chất khi chúng đi ra khỏi cột bằng cách cho dung dịch rửa giải điqua một bộ phận phát hiện gọi là detector đặt sau cột. 1.3. Phân loại những phương pháp sắc ký1. 3.1. Theo thực chất vật lý những phaPha động hoàn toàn có thể là một chất lỏng hay chất khíPha tĩnh hoàn toàn có thể là một chất rắn ( hạt xốp hay bột mắn ) hay một chất lỏng ( được giữtrên một chất mang rắn ). Do đó, dựa vào thực chất những pha ta phân biệt những phương pháp ( trong tên củaphương pháp, pha động được nêu trước pha tĩnh ) : • Sắc ký lỏng – lỏng ( liquid – liquid chromatography LLC ) • Sắc ký lỏng – rắn ( liquid – tuy nhiên chromatography LSC ) • Sắc ký khí – lỏng ( gas – liquid chromatography GLC ) • Sắc ký khí – rắn ( gas – solid chromatography GSC ) 1.3.2. Theo hiện tượng kỳ lạ sắc kýSắc ký hấp phụ ( absorption chromatography ) : pha tĩnh là một chất rắn có khảnăng hấp phụ, đó là những phương pháp sắc ký lỏng – rắn và khí – rắn. HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong điều tra và nghiên cứu và hóa sinh họcSắc ký phân bổ ( partition chromatography ) : pha tĩnh là chất lỏng không hoàlẫn được với pha động, chất lỏng này được bao trên mặt phẳng của một chất rắn gọi làgiá hay chất mang và phải là chất trơ, không tham gia vào sắc ký. Sắc ký phân bốbao gồm sắc ký lỏng – lỏng và sắc ký khí – lỏng. Sắc ký trao đổi ion ( ion – exchange chromatography ) : pha tĩnh là chất nhựatrao đổi ion chớp chất cao phân tử có mang những ion có năng lực trao đổi với cácion cùng dấu của dung dịch hỗn hợp sắc ký ). Sắc ký theo loại cỡ ( size – exclusion chromatography ) : còn gọi là sắc ký trêngel. Các phân tử cỡ lớn sẽ được loạt những phân tử nhỏ hơn sẽ được tách theo kíchthước do những phân tử nhỏ chuyển dời chậm hơn. 1.3.3. Theo kỹ thuật và phương tiện đi lại sắc kýPhương pháp giữ pha tĩnh : Sắc ký trên cột ( column chromatography : CC ) pha tĩnh được chứa trong mộtcột bằng sắt kẽm kim loại hay thuỷ tinh. Sắc ký lớp mỏng dính ( thin layer chromatography : TLC ) : pha tĩnh được tráng đềuvà giữ trên mặt phẳng của bản thuỷ tinh, nhựa hay nhôm. Lớp mỏng dính pha tĩnhthường là : silicagel, nhôm oxit, cenlulose, chất nhựa trao đổi lớn và có chiều dàykhoảng 0,25 – 0,5 mm. Sắc ký giấy ( paper chromatography – PC ) pha tĩnh ( lỏng ) được thấm trên mộtloại giấy lọc đặc biệt quan trọng gọi là giấy sắc kýTheo cách cho pha động chạy : Sắc ký khai triển ( development chromatography ) cho pha động kép những chấtchạy và tách trên pha tĩnh ( Sắc đồ nằm trên pha tĩnh ). HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong điều tra và nghiên cứu và hóa sinh họcSắc ký rửa giải ( elution chromatoglaphy ) cho pha động chạy và kép những chấtlần lượt ra ngoài pha tính ( ra khỏi cột, ra khỏi giấy ). Tốc độ chuyển dời của một chất, peak và hình dáng peakTốc độ vận động và di chuyển của một chấtTốc độ di chuyên của một chất hoàn toàn có thể được đặc trưng bởi thông số phân bổ của nógiữa hai pha hoặc bởi những đại lượng về sự lưu giữ của chất đó trên pha tĩnh ( thờigian lưu, thể tích lưu ) a. Thời gian lưu và thể tích lưuThời gian lưu là thời hạn cần để một chất vận động và di chuyển qua cột sắc ký, khi rakhỏi cột nhờ thiết bị detector ghi nhận tín hiệu và Open rực trên sắc đồ ( tính từlúc bơm mẫu đến khi Open peak ). Tm là thời hạn lưu của một chất không bị lưu giữ, nghĩa là vận tốc di chuyểncủa nó bằng vận tốc chuyển dời trung bình của dung môi, thời hạn này được gọi làthời gian chết. tR càng lớn, chất càng bị lưu giữ mạnh và vận tốc chuyển dời của nócàng nhỏ. b. Hệ số phân bốTrong đó : Cs và Cm là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động khi cân bằngđược thiết lập. Khi nồng độ nhỏ K phụ thuộc vào vào thực chất những pha, chất tan và nhiệtđộ K càng lớn thì chất đó phân bổ càng nhiều trong pha tĩnh và chuyển dời càngchậm. Peak và hình dáng peaka. Hình dáng peak : Hình dáng lý tưởng của tức là lực đối xứng, nhưng thực tiễn lúcsắc ký chỉ gần đối xứng. Chiều rộng của tục được đo ở 1/10 chiều cao của peak. b. Sự lê dài peak : là hiệu quả của sự vận động và di chuyển nhanh chậm khác nhau của những phântử của cùng một chất khi đi qua cột sắc khí. Các lực ra chậm khi nào cũng tù hơn. HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong điều tra và nghiên cứu và hóa sinh họcc. Hiệu lực của cột : Hiệu lực của cột thường được đo bằng hai thông số kỹ thuật : số đĩa lýthuyết N và chiều cao đĩa triết lý H. Ta hoàn toàn có thể coi như cột sắc khí được chia thànhN lớp hay N tầng mỏng dính, ở mỗi một lớp sự phân bổ chất tan vào hai pha đạt trạngthái cân đối. Những tầng mỏng mảnh giả định này được gọi là địa lý thuyết. Nếu cột sắckhí có chiều dài là L thì : H = N / L. Cột có N lớn là cột có hiệu lực hiện hành cao. 6 d. Độ phân giải : Độ phân giải Rs là tỉ số khoảng cách giữa hai peak và độ rộngtrung bìnhcủa peak. Rs = 0,75 hai pic tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều ; Rs = 1,0 hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4 % ; Rs = l, 5 hai pic tách trọn vẹn ( chi xen phủ 0,3 % ). 2. Các kỹ thuật sắc ký2. 1. Sắc ký giấySắc ký giấy là một phương pháp phân tách thuận tiện những thành phần của mộthỗn hợp ( acid amin ). Trong sắc ký giấy, pha tĩnh là một tờ giấy bằng cellulose ( thídụ như tờ giấy thấm, giấy lọc trong phòng thí nghiệm ). Các lọai giấy này có tính áinước nên trên thực tiễn, pha tĩnh là một lớp nước ( H2O ) thật mỏng mảnh đã được che phủlên trên mặt phẳng của tờ giấy, chính vì vậy sắc ký giấy là lọai sắc ký phân loại. Phađộng là chất lỏng ( hoàn toàn có thể là chất lỏng hay một hỗn hợp dung môi ). Phương pháp này thường được sử dụng để tách những chất ưa nước như aminoacid, đường, Trong giấy, cellulose có dạng sợi, những sợi này khi nằm cạnh nhau sẽtạo thành mạng lưới với những lỗ rỗng to. Khi ly giải, dung môi vận động và di chuyển dọc theo bềmặt sợi và những lỗ rỗng sẽ được phủ đầy dung môi. Như thế, những chất tan bị phân tánnhiều trong lỗ rỗng khiến những vết sắc ký to hơn. Bột giấy hấp thu nước, nước bị giữHVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong điều tra và nghiên cứu và hóa sinh họclại trong cấu trúc glucopyranose bằng cầu nối hydrogen, vì vậy quy trình sắc ký xảyra theo chính sách phân loại. Hình : Sắc ký giấy, những chất màu vận động và di chuyển theo dung môi lên giấy với cácđiểm khác nhau. ( a ) Một giọt hỗn hợp ( drop of mixture ) đặt ở một góc mảnh giấy lọc, một cạnh giấynằm trong dung môi. ( b ) Dung môi chuyển dời lên tấm giấy bằng lực hút mao mạch, những chất sẽ phân bốtheo những tỷ suất khác nhau Mỗi hợp chất vận động và di chuyển với vận tốc phản ánh kích thướccủa phân tử của nó và hòa tan của nó trong dung môi. ( c ) Những chất khác nhau sẽ được trải ra ở những điểm độc lạ trên bảng, tạothành một sắc ký đồ. Hiện nay, sắc ký giấy đang dần được thay thế sửa chữa bằng sắc ký lớp mỏng dính. Do phầnlớn những chất hữu cơ không có màu, nên sắc ký giấy sẽ không cho thấy được vị trícủa mẫu chất trong quy trình dung môi vận động và di chuyển đi lên giấy. HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong điều tra và nghiên cứu và hóa sinh họcNhược điểm sắc ký giấy : Trong giấy, cellulose ở dạng những sợi dài nằm songsong kề nhau một cách tự nhiên, và một mạng lưới hệ thống mạng như vậy chắc như đinh có những lỗhỗng. Khi dung môi giải ly chuyển dời ( mang theo những chất tan, solute ) dọc theo bềmặt của sợi, những lỗ rỗng này sẽ được dịp phủ đầy dung môi, và những chất tan có dịpkhuếch tán vào những lỗ rỗng này, khiến những chất tan càng lúc càng to dần so với vếtchấm tạo mức xuất phát ban đầu. Còn nếu sợi cellulose được nén chặt quá dòngchảy sẽ rất khó chuyển dời. 2.2. Sắc ký lớp mỏngSắc ký lớp mỏng mảnh là hay còn gọi là sắc ký phẳng ( planar chromatography ), dựachủ yếu vào hiện tượng kỳ lạ hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp cácdung môi, chuyển dời ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ ( thí dụ như : silicagelhay oxid alumin ). Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng dính, đều, phủ lên nền phẳngnhư tấm kiếng, tấm nhôm hay tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành mộtlớp mỏng dính nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng dính. Bình sắc ký : Một chậu, hũ, lọ bằng thủy tinh, hình dạng phong phú, có nắp đậy. Pha tĩnh : Một lớp mỏng mảnh khoảng chừng 0,25 nm của một loại hợp chất hấp thu ( silicagel, alumin, ) được tráng thành lớp mỏng dính, đều, phủ lên tấm kiếng, tấmnhôm, hay tấm plastic. Chất hấp thu trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bộthay một lọai polymer hữu cơ. Mẫu cần nghiên cứu và phân tích : thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khácnhau. Sử dụng khoảng chừng 1 ul dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5 %, nhờ một viquản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phái trên cao hơn mộtchút so với mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình. HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong điều tra và nghiên cứu và hóa sinh họcHình : Bình sắc ký lớp mỏngPha động : dung môi hay hỗn hợp 2 dung môi, vận động và di chuyển chầm chậm dọc theotấm lớp mỏng mảnh, và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi vận động và di chuyển càng cao nhờtính mao quản. Mỗi thành phần chất sẽ vận động và di chuyển với tốc độ khác nhau, đi phía sau mực củadung môi. Vận tốc vận động và di chuyển này phụ thuộc vào vào những lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnhmuốn níu giữ những mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy thuộc vào độ hòa tan của mẫu chấttrong dung môi. Ưu điểm : – Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích-Có thể nghiên cứu và phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện kèm theo phântích. – Tất cả những hợp chất trong mẫu nghiên cứu và phân tích hoàn toàn có thể được xác định trên tấm sắc ký lớpmỏng. Các bước triển khai sắc ký lớp mỏng mảnh : HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong điều tra và nghiên cứu và hóa sinh học-Chuẩn bị ống vi quản : ống thủy tinh có đường kính trong ống nhỏ, khỏang 1-2 mm, một đầu được vót nhọn, dài 10-20 cm. Sử dụng ống vi quản để chấm nhiềulọai mẫu dung dịch khác nhau, chỉ cần sau mỗi lần sử dụng, rửa sạch vi quản bằngdung môi hữu cơ như aceton. – Chuẩn bị tấm bản mỏng mảnh : tấm bản mỏng dính thương mại 20×20 cm, dùng kéo cắtbản với kiách thước thiết yếu, tấm bản phải vừa bình giải ly. Dùng bút chì vạch nhẹnét xuất phát và mức tiền tuyến dung môi. – Chuẩn bị dung dịch mẫu : Mẫu là chất lỏng, hoàn toàn có thể chấm trực tiếp mẫu lên bảnmỏng, còn mẫu là dung dịch quá sễt, hoàn toàn có thể pha loãng mẫu. Với mẫu là chất rắnphải hòa tan trong dung môi hữu cơ tương thích, nồng độ 2-5 %. Nhờ một vi quản đểdung dịch mẫu lên mặt phẳng tấm sắc ký lớp mỏng dính một cách thận trọng, tránh khôngcho làm lũng mặt phẳng của lớp mỏng dính. Mỗi vết chấm trên bản không chứa nhiều hơn12ug ( 10 ug là tối ưu ) mẫu chất. – Sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm, rồi nhúng bản vào dung dịch giảily-Giải ly để dung môi giải ly vận động và di chuyển lên : Sau khi bình đã bão hòa dung môi, người ta đặt tấm mỏng mảnh vào bình khai triển để cho những vết chấm mẫu ở bờ cạnh phíadưới đáy bình. Cạnh đáy của tấm lớp mỏng dính nậgp trong dung môi giải ly khỏang0. 5-1 cm. Các vết mẫu không được ngập trong dung môi giải ly, vì như thế dungmôi sẽ khuếch tán vào trong dung môi. – Hiện hình những vết sau khi giải ly : Các hợp chất có màu sẽ được nhìn thấybằng mắt thường, nhưng phần đông những hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếumuốn nhìn thấy những vết, cần sử dụng phuơng pháp vật lý ( Phát hiện bằng tia tửngoại UV : đèn chiếu tia UV 254 nm ánh sáng này nhận ra những hợp chất hoàn toàn có thể hấpthu tia UV, những hợp chất có màu tối sẫm trên nền sáng ; đèn chiếu tia UV 366 nm ánhsàng này phát hiện nhữgn hợp chất có phát huỳnh quang, những vết sẫm của chất mẫuHVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong điều tra và nghiên cứu và hóa sinh họccó màu sáng trên nền bản mỏng dính sẫm màu ) hay dùng phương pháp hóa học ( Bằngcách dung thuốc thử hiện hình như hơi iod, 2,7 – fluorescein phát hiện đa phần hợp chấthữu cơ, ninhydrin phát hiện aminoacid hay amin, 2,4 – dinitrophenylhydrazin pháthiện aldehyde hay caton, clorur antimony phát hiện steroid hay vitamin haycarotenoid, … ) – Ðại lượng đặc trưng cho mức độ chuyển dời của chất nghiên cứu và phân tích là thông số dichuyển Rf được tính bằng tỷ suất giữa khoảng chừng di dời của chất thử và khoảngdịch chuyển của dung môi : Trong đó : a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm. b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi củavết, tính bằng cm. Rf : Chỉ có giá trị từ 0 đến l. Hình : Các bước của quy trình sắc ký lớp mỏngHVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong điều tra và nghiên cứu và hóa sinh học2. 3. Sắc ký cột : Sắc ký cột được thực thi ở điều kiện kèm theo áp suất khí quyển. Pha tĩnh là những hạtcó kích cỡ tương đối lớn ( 50-150 um ), được nạp trong cột thủy tinh. Mẫu chấtcần nghiên cứu và phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh ( có một lớp thủy tinh che chởđể lớp mặt không bị trộn lẫn ), bình chứa dung môi giải ly được đặt phái trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặngay ống dẫn ra của cột. Phương pháp này thường làm cho quy trình tách bị chậm, hiệu suất cao thấp so với sắc ký lỏng cao áp ( HPLC ). Tuy vậy, sắc ký cột cũng có ưuđiểm là pha tĩnh và những dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, hoàn toàn có thể tiến hành với một lượngmẫu tương đối lớn. Các bước triển khai sắc ký cột : – Lựa chọn chất hấp thu : pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phâncực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau. Vơí 2 phân tửkhông phân cực, phân tử naò có trọng luợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnhhơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên chuyển dời ra khỏi cột chậm hơnso với những phân tử nhỏ, và cũng có khi nó ở lại lâu hơn trong cột so với phân tử tuycó tính phân cực. – Lựa chọn dung môi : Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan trọn vẹn trong dung môiphù hợp với nồng độ 10 mg / ml, gọi là dung dịch mẫu ( A ). Chuẩn bị 4-6 tấm bảnmỏng 2,5 x10cm. Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng chừng 2-5 ul dd ( A ). Mỗibản mỏng mảnh được tiến hành với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế đó phát hiệnbằng đèn UV hay thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ thuận tiện thấy được dung môi nàophù hợp. Từ tác dụng đó, nỗ lực tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môiphân cực và một dung môi kém phân cực thí dụ như ete dầu hỏa : etyl acetate. – Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột : dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng chừng 2/3 chiều cao cột. Cho chất hấpHVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong điều tra và nghiên cứu và hóa sinh họcthu dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa khỏnhẹ vào thành cột. Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao khoảng chừng 2 cm trong cột, thì mở nhẹ khoá ở bên dưới để cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một bechertrống để bên dưới cột, dung môi này dẽ được rót lại lên đầu cột. Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi chất hấp thu trong cột đồngnhất. – Nạp mẫu : Mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký. Nếu mẫu ở dạngrắn thì hoà tan mẫu chất vào trong một lượng nhỏ dung môi, loại dung môi cho khởiđầu sắc ký. Thực hiện nạp mẫu lên cột như sau : + Mở khoá cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cộtxuống sao cho vừa sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột. + Đóng khoá lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột. Muốn nạp mẫu, sử dụng mộtpipet hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu pipet gần sát mặt thoáng cảu chất hấp thutrong cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành cột cho dung dịch chảy ra theothành trong của cột, chạm xuống mặt phẳng chất hấp thu. + Mở khoá bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịch mẫuđược thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột, cần canh chừng không cho chất hấpthu đầu cột bị khô. + Dùng pipet cho một luợng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, đồng thời dùngdung môi này để rửa sạch ống mà dung dịch dính trên thành cột. + Mở khoá cho dung môi chảy ra. Lặp laị vài lần giúp cho dung dịch mẫu thấmsâu vào chất hấp thu, dung môi trong suốt không lây màu của chất mẫu. + Sử dụng bông thủy tinh, bông gòn, cát hay giấy lọc đặt nhẹ lên mặt thoángchất hấp thu để bảo vệ mặt cột. + Cho dung môi vào đầy cột để triển khai giải ly trên cột. HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong điều tra và nghiên cứu và hóa sinh học2. 4. Sắc ký trao đổi ionSự trao đổi ion là sự kết nối có đặc thù thuận nghịch giữa những phân tử cómang điện tích. Trong sắc ký cột nhồi, pha tĩnh R có gắn thêm nhóm chức G mangđiện tích. Giả sử cho đi ngang qua cột một hỗn hợp mẫu chất bắt đầu có chứa nhiềulọai chất tan ( solute ) khác nhau, chất tan nào có mang điện tích ngược dấu với điệntích của nhóm chức, thí dụ chất tan S, chất tan dễ đuổi đối ion C ra thế chỗ vào, đểgắn vào pha tĩnh, và như thế chất tan sẽ bị giữ lại trong cột, trong khi đó những chấtkhác của hỗn hợp mẫu chất khởi đầu sẽ không bị giữ lại nên đi ra khỏi cột. kỹ thuậtnày tách riêng được hợp chất S ra khỏi hỗn hợp khởi đầu. RG – + S + Æ RG-S + + C + Hoặc RG + + S – Æ RG + S – + C-Trong đó : R là pha tĩnh hay gọi là nhựa ( resin ), G là nhóm chức mang điệntích được cố định và thắt chặt trên pha tĩnh hay còn gọi là nhóm chức họat động của nhựa. C làđối ion của G. S là chất hữu cơ có mang điện tích trái dấu với G.Các loại hạt nhựa trao đổi ion : nhựa polystyren, silicagel, polymercarbohydrate. Các bước trong sắc ký trao đổi ion : – Nhồi nhựa trao đổi ion vào cột : Giữ cột thẳng đứng trên giá, khóa vòi bêndưới cột. Nhựa trao đổi ion đã đã được cân đối trong dung dịch đệm, lượng nhựavà thể tích dung môi sao cho hoàn toàn có thể rót nhựa thuận tiện vào cột, không tạo ra nhữngbọt khí nằm giữ những hạt nhực. Để yên 5-10 phút cho những hạt nhựa lắng xuống, rótđầy cột bằng dung dịch đệm, mở khóa để cho hạt nhựa lắng xuống. Khi nhồi cộthoàn tất, cần cân đối cột bằng chách cho dung dịch đệm chày qua cột, cuối cùngkiểm tra pH của dung dịch chảy ra khỏi cột. HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong nghiên cứu và điều tra và hóa sinh học-Nạp mẫu chất lên đầu cột : dung dịch mẫu được lọc trong suốt trước khi nạpvào cỗt, lọc bằng tờ giấy lọc hay ngang qua một lớp celite. Lượng mẫu tùy vàolượng nhựa cũng như năng lực trao đổi của nhựa. Đầiu quan trọng nhất là làm saođể cho toàn bộ những cấu tử quan trọng của mẫu chất được hấp thu hết vào nhựa, tức làchú ý số lượng mẫu hơn là thể tích của mẫu. Để nạp mẫu lên cột : mở khóa để hạmức dung dịch đệm xuống vừa sát mức nhựa ở trên đầu cột, khóa lại. dùng pipethút và đặt dung dịch mẫu lên đầu cột, mở khóa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựaở trên đầu cột. Để yên 10-20 phút để cho mẫu chất tiếp xúc cân đối với nhựa. – Khi tổng thể mẫu đã được gắn lên đầu cột nhựa, cho vài ml dung dịch đệm banđầu chảy qua, nối cột với bình cung ứng dung dich giải ly. – Giải ly bằng cách tắng dần nồng độ dung dịch giải ly : hỗn hợp mẫu đang gắnvào nhựa trao đổi ion trong dung dịch đệm có nồng độ thấp. Để hoàn toàn có thể tách mẫuchất ra khỏi nhựa thường, cần phải gia tăng lực ion của dung dịch đệm bằng cáchcho thêm NaCl. Khi có thêm NaCl trong dung dịch đệm, ion của dung dịch đệm sẽcạnh tranh với hỗn hợp mẫu chất, để giành lấy những nhóm chức họat động cảunhựa, đẩy hợp chất ra khỏi nhựa, rồi theo dòng chảy đi ra khỏi cột. Trong phương pháp sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là những hạt mang sẵn mộtđiện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với những phân tử ( protein ) mangđiện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm ( như cộtcarboxymethyl-cellulose ( CM-cellulose ) ), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi iondương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. trái lại, nếuhạt mang điện tích dương ( như cột diethylaminoethyl-cellulose ( DEAE-cellulose ) ), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấubị giữ lại cột. Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, nhữngion này sẽ thế phân tử protein tương tác với những hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắcHVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong nghiên cứu và điều tra và hóa sinh họcký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịchtách giải do tại ion natri sẽ tranh bám vào cột với những protein có điện tích dương, dođó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theođộ lớn về điện tích. 2.5. Sắc ký gelTrong sắc ký gel, pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng và những lỗ rỗng nàyđược phủ đầy dung môi dùng làm pha động. Một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất cótrọng lượng phân tử khác nhau cò thể tách riêng được hay không là tuỳ vào kíchthước lỗ rỗng. Các phân tử có size lớn hơn lỗ rỗng, không hề chui lọt vàobên trong lỗ rỗng, nhanh gọn theo dòng chảy của pha động đi ra khỏi cột. cácphân tử có khối lượng phân tử ( TLPT ) nhỏ hơn kích cỡ lỗ rỗng, sẽ toàn phầnhay bán phần lọt vào lỗ rỗng, tuy rằng ở đầu cuối rồi cũng theo dòng chảy đi ra khỏicột nhưng sẽ chậm trễ hơn. Dòng chảy pha động khiến những phân tử lớn không thểchui vào lỗ rỗng của mạng gel, nhanh gọn đi xuyên qua cột, ra khỏi cột, trong khiphân tử nhỏ ra khỏi cột lâu hơn vì còn chui vào và đi ra khỏi lỗ rỗng của gel. Nhưvậy, những thành phần khác nhau của hỗn hợp mẫu khi đi ngang qua cột sắc ký gel, sẽra khỏi cột lần lượt theo trình tự TLPT lớn đi ra khỏi cột trước, phân tử nhỏ đi rakhỏi cột sau. Sắc ký gel phải thực thi trong cột hình ống trụ bằng thuỷ tinh, gồm những bướcsau : Nhồi gel vào cột : những hạt gel trương nở hiện hữu ở dạng huyền phù trongdung môi tương thích cho vào cột. Huyền phù được chỉnh sao cho thật sệt nhưng khirót vẫn chảy vào cột thành dòng thuận tiện. Cân bằng cột bằng cách cho dung môigiải ly chảy ngang qua cột, lượng dung môi có thể tích bằng 2-3 lần thể tích cột. Kiểm tra sự ngặt nghèo của cột bằng cách cho một lượng mẫu thử vào đầu cột. mẫuHVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong nghiên cứu và điều tra và hóa sinh họcthử thường được chọn là dextran blue 2000, có màu xanh dương để hoàn toàn có thể đượcquan sát bằng mắt thường sự vận động và di chuyển của mẫu trong cột. Đặt mẫu cần sắc ký lên đầu cột gel : dung dịch mẫu cần phân tách phải đượclọc bỏ những hợp chất còn ở dạng rắn, cặn. Dung dịch mẫu hoà tan vào dung dịchđệm, đặt lên đầu cột giống như sắc ký cột. Triển khai sắc ký gel : tiến hành giải ly rất đơn thuần, chỉ sử dụng kỹ thuật dungmôi đơn nồng độ ( nghĩa là sử dụng một loại dung môi hay hỗn hợp hai dung môi, khi mở màn cho tới khi kết thúc quy trình giải ly chỉ sứ dụng một loại dung môi đó ). giải lycó thể bằng trọng tải nhưng rất tốt khi sử dụng bơm đẩy từ đầu cột. hứngdung môi giải ly trong những lọ nhỏ, mỗi lọ có một thể tích nhất định. Các chất tansẽ ra khỏi cột theo thứ tự TLPT giảm dần. Ứng dụng : kỹ thuật này dùng để tách những đại phân tử có nguồn gốc sinh họcnhư : protein, polysaccharide, acid nuleic, enzyme, Người ta ứng dụng vào việcđóan TLPT của một hợp chất chưa biết. 2.6. Sắc ký ái lựcSắc ký ái lực hấp thụ phát hiện những ái lực sinh học mà một phân tử sinh học cóvới một phân tử khác được cố định và thắt chặt trên một pha không thay đổi. Có nhiều phương phápđể rửa giải những phân tử ái lực vì có nhiều loại sắc ký ái lực khác nhau, những bước theogradient vẫn thường được sử dụng. Thường sử dụng trên những mạng lưới hệ thống có áp suấtthấp. Các giá thể ( thường là agarose ) thường chịu được áp suất dưới 50 psi. Nhược điểm : đắt tiền, khó tẩy rửa, tinh lọc ligand ( phối tử ), kết nối ligandlên giá thể hoạt hóa thường gặp nhiều khó khăn vất vả. Ưu điểm : tăng trưởng phương pháp tinh sạch trên protein A ( protein A làantigen cho IgG ), bước bắt giữ tốt, được cho phép phân tách protein dạng nguyên thủycòn họat tính với dạng biến tính. HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong điều tra và nghiên cứu và hóa sinh họcSử dụng sắc ký ái lực cho tương tác giữa kháng nguyên kháng thể : ta có thểtinh sạch một kháng nguyên bằng cách cho mẫu đi qua cột có chứa giá thể liên kếtvới kháng thể để thu nhận protein. trái lại, một giá thể có link với một khángnguyên chuyên biệt sẽ bắt giữ kháng thể chuyên biệt cho kháng nguyên đó. Ứngdụng nhiều nhất là kết nối protein A vào gel để kết nối với những globulin miễn dịch. 2.7. Sắc ký tương tác kỵ nướcSắc ký tương tác kỵ nước là phuơng pháp bổ trợ khá tốt cho những kỹ thuậtphân tách khác. Trong những năm gần đây, phương pháp này trở nên thông dụngnhư là bước tiên phong trong quy trình sắc ký. Loại hạt Macro-Prep có dẫn xuất là nhóm kỵ nước, hoàn toàn có thể là gốc methyl hay t-butyl. Các gốc này mê hoặc những gốc kỵ nước khác có trên mặt phẳng protein. Khi chomẫu protein vào trong điều kiện kèm theo nồng độ muối cao ép những phần kỵ nước lại gầnnhau và đính với nhau. Quá trình rửa giải được thực thi bằng cách giảm dần nồngđộ muối cho đến khi những phần kỵ nước đi lại vào trong dung dịch. Đặc điểm : Phân tách những phân tử theo tính kỵ nước của phân tử. Các nhóm kỵnước khác nhau đựợc cố đinh trên mặt phẳng giá thể. Dưới điều kiện kèm theo nồng độ muối cao ( thấp ) những phần kỵ nước trênphân tử tương tác những nhóm cố định và thắt chặt. Các phân tử kết nối được rứa giải bằngcách giảm áp lực đè nén ion và thế cho nên hòa tan những phân tử ra khỏi giá thể. Ưu điểm : Là bước được cho phép cô mẫu, hiệu suất cao, nhanh, mẫu được thu nhậntrong nồng độ muối thấp. Nhược điểm : 1 số ít protein hoàn toàn có thể bị tủa ở nồng độ muối cao, khó nâng cấpquy mô lớn. 2.8. Sắc ký khíHVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong nghiên cứu và điều tra và hóa sinh họcSắc ký khí là phương pháp được dùng để tách những chất ở thể khí bay hơi, vớipha động là chất khí, gọi là khí mang ( carrier gas ). Sắc ký khí còn vận dụng cho cácchất khí, lỏng, rắn dễ bay hơi và bền nhiệt độ cao, có TLPT M < 500. Sắc ký khí rắn ( GSC - gas solid chromatography ) : pha tĩnh rắn là một chất hấpphụ, đây là sắc ký khí hấp phụ và sắc ký khí lỏng ( GLC - gas liquidchromatography ) : pha tĩnh lỏng được bao hay gắn trên một chất mang rắn ( solidsupport ) đây là sắc ký khí phân bổ. Sử dụng phương pháp sắc ký khí có năng lực tách được trọn vẹn những chấthữu cơ tựa như, ví dụ như o - ; m - ; p-xilen không hề tách được bằng phương phápchưng cất phân đoạn nhưng tách được khá đơn thuần bằng sắc ký khí, cũng như sửdụng đề tách những hỗn hợp rất phức tạp như khí thải xe hơi chứa trên 300 hợp chất. Với việc sinh ra của nhiều loại detector nhiều phương pháp mới Open như : sắcký khí - khối phổ ( GS - MS ), sắc ký khí - hồng ngoại ( GC - IR ) đã làm tăng khảnăng nghiên cứu và phân tích của sắc ký khí. Hình : Sơ đồ của một máy sắc ký khí1. Khí mangHVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong nghiên cứu và điều tra và hóa sinh họcKhí mang là một khí trơ như nhờ, hen, ngon, hidro trong đó hai là khí mangphổ biến nhất. Khí được chứa trong bom khí có gắn van giảm áp và kiểm soát và điều chỉnh. Khímang cần có độ tinh khiết cao và phải không tương tác với mẫu, chỉ mang mẫu điqua cột : Tín hiệu đetectơ có nhờ vào vào sự khác nhau về đặc thù giữa khí mangvàchất cần nghiên cứu và phân tích. 2. Bộ bơm mẫuThường dùng bơm tiêm đề bơm trực tiếp mẫu qua một vách polime siliconchịu nhiệt cao vào cột hoặc vào phòng đun nóng mẫu để mẫu lỏng hoàn toàn có thể bay hơinhanh chóng. Yêu cầu cần 15 thiết là mẫu phải có đủ áp suất hơi để hoàn toàn có thể được làmbay hơi trong phòng mẫu. Nhiệt độ phòng mẫu hoàn toàn có thể cao hơn nhiệt độ trong cộtmột chút để quy trình bay hơi được thực thi thuận tiện. 3. Cột sắc kýCột được đặt trong lò hoàn toàn có thể kiểm soát và điều chỉnh nhiệt độ trong quy trình thực thi. Cộtthông dụng nhất trong nghiên cứu và phân tích là những ống bằng thép không rỉ ( đồng, thép ) hoặcbằng thuỷ tinh dài từ 1 đến 10 m và có đường kính từ 2 đến 4 mm. Chúng được uốncuộn tròn cho khớp với phòng lò. Cột được nhồi bằng những thành phần rắn hoạt độngnhư một pha tĩnh ( GSC ) : đó là những hạt nhỏ xếp gắn trên mặt trong cột hoặc phatĩnh được tẩm trên những hạt nhỏ đó. Trong sắc ký khí lỏng ( GLC ), pha tĩnh được giữtrên chất mang, đó là những hạt chất rắn nhỏ, bền nhiệt, trơ về mặt hoá học, có lỗ cỡ1 - 5 μm, mặt phẳng riêng lớn từ 1 - 10 mét vuông / g. Pha tĩnh phải chịu nhiệt, hoá lỏng ở nhiệtđộ nghiên cứu và phân tích, trơ về hoá học. Thường hay sử dụng những polyme xốp hoặc gelaluminosilicat khử nước. 4. DetectorYêu cầu về detector rất khắt khe : Mọi hợp phần có trong 0,1 μl mẫu phảiđược phát hiện ở mức 1 % do đó phải nhanh gọn phát hiện được 0,002 μl ( cókhối lượng cỡ 10-6 g ) mẫu. Các detector lúc bấy giờ đo được những lượng nhỏ hơnHVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong nghiên cứu và điều tra và hóa sinh họcđến mấy bậc. Hiện nay trong phương pháp GC người ta sử dụng những loại detectorsau : Detector dẫn nhiệt ( TCD ) : Việc quản lý và vận hành của detector dựa trên sự cân bằngnhiệt cửa một dây dẫn nung nóng. Khi có chất cần nghiên cứu và phân tích đi qua thì độ dẫn điệncủa hỗn hợp khí sẽ thấp đi, dây sẽ nóng lên, Open một tín hiệu điện. Detectordẫn nhiệt thích hợp với nhiều chất cần nghiên cứu và phân tích. Detector ion hoá ngọn lửa ( FID ) : Khi đốt cháy những hợp chất hữu cơ trong ngọnlửa, chúng sẽ tạo ra những ion. Các điện cực ở gần ngọn lửa sẽ phát hiện ra sự có mặtcủa những ion bằng sự Open một dòng điện nhỏ chạy qua mạch điện. Có thể đođược những dòng ngay cả khi chứng từ xấp xi bằng 10-122. 9. Sắc ký lỏng cao áp ( HPLC ) - Áp dụng cho nghiên cứu và phân tích mẫu dạng lỏng, rắn có TLPT M > 2000. – Các thành phầnchính của máy sắc ký lỏng hiệu năng caoBình chứa dung môiThường làm bằng thuỷ tinh, đôi lúc làm bằng thép không rỉ, trong phương pháp rửagiải thường thì chỉ cần một bình chứa dung môi, trong phương pháp rửa giảigradient thường dùng 2, 3, 4 bình chứa những dung môi khác nhau và hệ dung môi rửagiải là hỗn hợp của những loại dung môi trên trộn lẫn với nhau theo ti lệ đã được xácđịnh. Cần loại những hạt và những khí hoà tan trong dung môi. Hệ thống bơmBơm dùng trong phương pháp phải tạo được áp suất cao ( 3000 – 6000 psi haykhoảng 250 – 500 at ), lưu lượng bơm khoảng chừng 0,1 đến 10 ml / ph, phải trơ với cácdung môi. Hệ thống bơm này phải có năng lực bơm pha động qua cột ở áp suất caomà không bị ngắt quãng hoặc tạo nhịp sóng hoàn toàn có thể làm xô lệch những lực thu được. CóHVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy TrangKỹ thuật sắc kýỨng dụng trong nghiên cứu và điều tra và hóa sinh họcnhiều kiểu bơm đã dùng trong những máy HPLC ; nhưng kiểu phông xoay chiều hiệnnay được dùng phổ cập nhất. Hệ bơm mẫu ( hệ tiêm mẫu ) Mẫu được bơm vào cột nhờ mạng lưới hệ thống van mẫu. Người ta bơm mẫu vào vòng mẫuvới thể tích thường là từ 10 đến 20 μl. Cột sắc ký : Kiểu cột thường nhờ vào vào phương pháp dùng để tách, nhưngthường là những cột bằng thép không gỉ, có cỡ lỗ đúng chuẩn đường kính từ 3 đến 4 túm và dài từ 10 đến 30 cm ( những cột dùng cho SEC đường rộng hơn và dài đến100cm ). Loại cột này có hiệu lực thực thi hiện hành rất cao, có số ( ra triết lý lên đến 100.000 đĩa cho1m chiều dài cột ) Detector : Là bộ phận phát hiện những chất khi chứng ra khỏi cột và ghi nhận những tínhiệu ghi trên sắc ký đồ. Hiện đang sử dụng những loại detector sau : Detector tử ngoại ( UV ) : Dùng đèn thuỷ ngân cho vạch 254 nm. Nhiều chất hấp thụ ở bước sóng này. Detector tử ngoại và khả kiến ( UV-VIS ) : Dùng phổ quang kế lựa chọn bước sóng từ195 đến 750 nm. Loại này lúc bấy giờ được dùng nhiều nhất. Detector điện hoá vàdetector huỳnh quang có độ nhạy và độ tinh lọc cao dùng trong nghiên cứu và phân tích vết. Dùng detector điện hoá hoàn toàn có thể phát hiện được những lượng picrogam ( 10-12 g ) Các phương pháp sắc ký hiệu nâng cao2. 9.1. Sắc ký phân bổ hiệu nâng caoGồm hai loại : Sắc khí lỏng – lỏng và sắc ký pha link. – Sắc ký lỏng – lỏng ( LLC ) : Pha tĩnh là chất lỏng được bao trên mặt phẳng của những hạtchất mang, tức là được hấp phụ trên chất mang. – Sắc ký pha link ( BPC ) : Pha tĩnh được gắn hoá học với chất mang tạo ra liênkết siloxan nối nhóm cơ – silic với silicagen. HVTH : Huỳnh Công Tài – Lê Hoàng Thanh Vy Trang

Source: https://mindovermetal.org
Category: Ứng dụng hay