KỸ THUẬT ELISA VÀ NHỮNG ĐIỀU CẦN LƯU Ý

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assa), là một kỹ thuật sinh hóa phát hiện sự hiện diện của một kháng thể hoặc kháng nguyên trong một mẫu bằng phản ứng miễn dịch đặc hiệu. Cụ thể, kháng nguyên/ kháng thể (Tùy loại kỹ thuật ELISA) được phủ lên bề mặt giếng, sau đó thêm một kháng thể đặc hiệu đã liên kết với một loại enzyme, và cuối cùng thêm cơ chất để enzyme phân giải cơ chất sinh ra chất mang màu.

1. Cơ chế của kỹ thuật ELISA?

Kỹ thuật ELISA là phản ứng miễn dịch bao gồm ít nhất một kháng thể bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên cụ thể. Tùy theo loại ELISA mà cơ chế có sự thay đổi.

Sau khi kháng nguyên được cố định và thắt chặt vào thành giếng, những kháng thể phát hiện được thêm vào và tạo thành một phức tạp kháng nguyên – kháng thể. Các kháng thể phát hiện được link với một loại enzyme, hoặc được link với một kháng thể thứ cấp mang enzyme ( trải qua link cộng hóa trị giữa những phân tử sinh học ). Số lượng enzyme phân hủy cơ chất tỉ lệ thuận với cường độ màu, qua đó, tỷ suất với lượng kháng nguyên khởi đầu .
Giữa mỗi bước, các đĩa giếng thường được rửa bằng dung dịch tẩy nhẹ để loại bỏ các protein hoặc các kháng thể tự do.

2. Dụng cụ thiết bị cần thiết cho kỹ thuật ELISA

– Đĩa giếng ELISA pha rắn
Thông thường, đĩa ELISA có 96 giếng, thường là polystyrene hoặc các dẫn xuất của polystyrene. Chúng được chia thành 8 hàng và 12 cột. Thể tích mỗi giếng khoảng 350 µl.

Một vài năm gần đây, cũng Open đĩa 384 giếng và 1536 giếng với kích cỡ toàn diện và tổng thể giống như đĩa truyền thống cuội nguồn 96 giếng. Các loại đĩa lớn này được sử dụng trong việc kiểm tra lượng mẫu lớn .
Ngoài ra, cũng có đĩa 96 giếng nhưng thể tích chỉ bằng 50% thể tích giếng truyền thống lịch sử giúp tiết kiệm chi phí đáng kể thành phần tham gia phản ứng .

– Micro Pipet đơn kênh và đa kênh

Có 2 loại pipet thường được sử dụng là pipet đa kênh và pipet đơn kênh .
Pipet đơn kênh thông dụng với những thể tích hút như : 1 – 20 µl, 10 – 100 µl, 20 – 200 µl …
Pipet đa kênh : có 2 loại là 8 đầu tip và 12 đầu tip tương ứng với với số lượng hàng và cột của đĩa ELISA .
Mẫu và chuẩn hoàn toàn có thể được thêm vào bằng pipet đơn kênh. Các hóa chất dùng những lượng xác lập giống nhau cho những giếng hoàn toàn có thể thêm vào bằng pipet đa kênh để giảm thiểu chênh lệch thời hạn lên màu giữa chuẩn và mẫu, đồng thời giảm % CV.

– Máy rửa kit ELISA

Thao tác rửa bằng tay hoàn toàn có thể làm mặt phẳng giếng bị khô, làm sạch giếng không đều dẫn tới % CV cao. Khi lượng mẫu nhiều, bạn hoàn toàn có thể trang bị cho phòng thí ngiệm của mình mạng lưới hệ thống rửa tự động hóa .
Có thể chia thành 2 loại máy rửa : rửa một hàng hoặc cột và rửa một lúc cả đĩa hoặc rửa một lần nhiều đĩa. Tùy thuộc vào mục tiêu việc làm mà ta lựa chọn loại máy tương thích .

– Máy đọc kết quả ELISA

Tương tự máy rửa ELISA, máy đọc ELISA cũng hoàn toàn có thể chia thành : máy hoàn toàn có thể đọc một hàng hoặc cột trong một lần, hoàn toàn có thể đọc hiệu quả của cả đĩa cùng một lần hoặc đọc tác dụng nhiều đĩa cùng một lúc .
Cũng có những mạng lưới hệ thống máy ELISA tự động hóa thay bạn thực thi tổng thể những thao tác trên .
ThunderBolt là một ví dụ. Đây là một hệ hoàn toàn tự động, bao gồm tất cả các bước như xử lý mẫu, pha loãng, phân phối, ủ và rửa.  ThunderBolt cũng bao gồm máy đo và đánh giá theo phương pháp phát quang và trắc quang. Tất cả quy trình được thực hiện bằng phần mềm điều khiển được thiết kế riêng. 

https://mindovermetal.org/vi/shops/phong-thi-nghiem/he-thong-elisa-tu-dong-thunderbolt.html

3. Các kỹ thuật ELISA

a) Kỹ thuật ELISA trực tiếp

Kỹ thuật ELISA trực tiếp: là phương pháp ELISA đơn giản nhất, kháng nguyên (Antigen-Ag) được hấp phụ lên bề mặt giếng, sau đó thêm vào một lượng lớn của một loại protein (thường là albumin huyết thanh bò- BSA) được để khóa tất cả các vị trí liên kết khác. Phức hợp enzyme-kháng thể được thêm vào và bị hấp phụ giữ lại bởi các kháng nguyên. Sau khi phức enzyme-kháng thể dư thừa bị loại bỏ hết, phức hợp enzyme- kháng thể nào gắn với kháng nguyên sẽ còn lại trên giếng. Bằng cách thêm vào cơ chất bị phân hủy bởi enzyme, tín hiệu phát ra đại diện cho lượng kháng nguyên trong mẫu.

b) Kỹ thuật ELISA gián tiếp 

Kỹ thuật ELISA gián tiếo: Các bước tiến hành cũng tương tự ELISA trực tiếp nhưng sau khi kháng nguyên được hấp thụ vào các đĩa, và sau bước cho BSA, các kháng thể tiếp theo sẽ được thêm vào là các kháng thể sơ cấp, chọn lọc đặc hiệu với các kháng nguyên (kháng thể này không gắn enzyme). Sau đó, một kháng thể thứ cấp gắn enzyme đã được chuẩn bị sẽ được thêm vào đĩa nhằm phát hiện các kháng thể hấp phụ với kháng nguyên
 

c) Kỹ thuật ELISA sandwich

ELISA sandwich là một loại ít phổ biến của kỹ thuật ELISA nhưng cho độ nhạy cao.
ELISA sandwich định lượng kháng nguyên giữa hai lớp kháng thể (kháng thể bắt- capture và phát hiện- detection). Các kháng nguyên được định lượng phải chứa ít nhất hai epitope kháng nguyên có khả năng liên kết với 2 kháng thể.
Các kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng đều có thể được sử dụng như là các kháng thể bắt và kháng thể phát hiện trong hệ thống ELISA sandwich.

• Kháng thể đơn dòng có một epitope ​(là vị trí trên kháng nguyên, nơi gắn với kháng thể) duy nhất cho phép phát hiện và định lượng tốt sự khác biệt nhỏ trong kháng nguyên.
• Kháng thể đa dòng, ngược lại, thường được sử dụng bắt giữ càng nhiều kháng nguyên càng tốt.

Quy trình ELISA sandwich hoàn toàn có thể khó khăn vất vả để tối ưu hóa và cần phải kiểm tra những kháng thể bắt cặp sai .

Các bước thực hiện:

• Chuẩn bị bề mặt chứa các kháng thể bắt.
• Khóa các vị trí bám không đặc hiệu trên bề mặt.
• Cho các mẫu có chứa kháng nguyên vào giếng.
• Rửa đĩa, để loại bỏ các kháng nguyên tự do.
• Thêm kháng thể phát hiện vào.

• – Đơn lớp: Kháng thể phát hiện đã gắn Enzyme.
• – Hai lớp (Double Sandwich): Thêm tiếp kháng thể thứ cấp có liên kết enzyme, kháng thể này sẽ liên kết đặc hiệu với vùng Fc của kháng thể phát hiện.

• Rửa đĩa, để các liên kết enzyme – kháng thể không gắn bị loại bỏ.
• Thêm cơ chất của enzyme để tạo màu hoặc tín hiệu huỳnh quang hoặc điện hóa.
• Đo độ hấp thụ hoặc huỳnh quang hoặc tín hiệu điện của các giếng để xác định sự có mặt và số lượng kháng nguyên.

Kháng thể phát hiện sơ cấp (đặc hiệu cho mỗi kháng nguyên) có thể liên kết với enzyme tạo ra sandwich đơn lớp. Tuy nhiên, việc phải tạo nhiều loại phức hợp (enzyme – kháng thể sơ cấp) khác nhau sẽ tốn kém. Bằng việc dùng 1 kháng thể thứ cấp không đặc hiệu, việc tạo ra phức hợp (kháng thể – enzyme thứ cấp) trở nên đơn giản hơn.
 
(1) Đĩa được phủ một lớp kháng thể bắt giữ; (2) Thêm mẫu, bất kì kháng nguyên nào có mặt sẽ liên kết với kháng thể bắt giữ; (3) Kháng thể phát hiện được thêm vào; (4) Kháng thể thứ cấp liên kết enzyme được thêm vào, và gắn với kháng thể phát hiện; (5) Thêm cơ chất của enzyme và phát tín hiệu.Kháng thể phát hiện sơ cấp ( đặc hiệu cho mỗi kháng nguyên ) hoàn toàn có thể link với enzyme tạo ra sandwich đơn lớp. Tuy nhiên, việc phải tạo nhiều loại phức tạp ( enzyme – kháng thể sơ cấp ) khác nhau sẽ tốn kém. Bằng việc dùng 1 kháng thể thứ cấp không đặc hiệu, việc tạo ra phức tạp ( kháng thể – enzyme thứ cấp ) trở nên đơn thuần hơn. ( 1 ) Đĩa được phủ một lớp kháng thể bắt giữ ; ( 2 ) Thêm mẫu, bất kỳ kháng nguyên nào xuất hiện sẽ link với kháng thể bắt giữ ; ( 3 ) Kháng thể phát hiện được thêm vào ; ( 4 ) Kháng thể thứ cấp link enzyme được thêm vào, và gắn với kháng thể phát hiện ; ( 5 ) Thêm cơ chất của enzyme và phát tín hiệu .

d) Kỹ thuật ELISA cạnh tranh 

ELISA cạnh tranh là quá trình gắn cạnh tranh kháng nguyên gốc (kháng nguyên mẫu) và kháng nguyên được thêm vào (Inhibitor Antigen) (kháng nguyên trong chuẩn, trong mẫu…) để gắn vào một kháng thể được đánh dấu xác định.

– Kháng nguyên gốc ( đối chứng ) được phủ trước trên đĩa giếng .
– Mẫu và kháng thể được ghi lại được thêm vào những giếng và ủ. Kháng nguyên tự do và kháng nguyên trên thành giếng cạnh tranh đối đầu bám vào kháng thể .
– Kháng thể không bám được sẽ bị vô hiệu trải qua bước rửa đĩa .
– Các kháng thể thứ cấp gắn enzym mà đặc hiệu với những kháng thể sơ cấp sẽ được thêm vào. ​
– Thêm cơ chất, enzyme phân giải cơ chất và tạo tín hiệu màu hoặc huỳnh quang. Màu càng mạnh, chứng tỏ càng nhiều kháng thể bị giữ lại. Điều này có nghĩa là càng có nhiều kháng nguyên trong mẫu thì càng ít kháng nguyên tham chiếu được phát hiện và tín hiệu càng yếu .

4. Lưu ý khi ứng dụng của kỹ thuật ELISA

• – Nếu một protein có nhiều epitope được phát hiện, thử nghiệm sandwich là một lựa chọn tốt. Thử nghiệm này đòi hỏi hai kháng thể phản ứng với các epitope khác nhau.
• – Nếu nền mẫu tinh sạch mà có thể được hấp thu một cách hiệu quả trong giếng, ta có thể thiết lập kỹ thuật ELISA cạnh tranh.
• – Phân tích acid amin: Đĩa polystyrene có độ bám từ trung bình đến thấp có thể gắn 100-200 ng IgG/cm2, trong khi đĩa có độ bám cao thường có thể gắn lên đến 400-500 ng IgG/cm2. Ngoài protein, đĩa polystyrene còn hấp thụ các peptide có chiều dài từ 15 – 20 axit amin. Để đạt được liên kết mạnh, một peptide sẽ cần cả hai tương tác kỵ nước và ưa nước. Thông thường, nhược điểm để hấp phụ peptide trực tiếp (elisa trực tiếp) là peptit có xu hướng có ít epitope, và nếu chúng tương tác với nhựa, việc kháng thể bắt peptide sẽ gặp khó khăn. Một giải pháp khác là gắn các peptide lên một protein lớn hơn thông qua một đoạn spacer- nhằm cung cấp khoảng cách giữa các peptide và protein, cho phép các kháng thể tương tác được với các peptide.
• – Xét nghiệm phát hiện một tế bào vi khuẩn hay virus cũng có thể sử dụng kỹ thuật ELISA sandwich với kháng thể tương tự cho cả bắt và phát hiện. Nếu các phân tử đích (tế bào vi khuẩn hay virus) chỉ có một epitope duy nhất, cần gắn vào các protein lớn hơn, tạo ra một cấu hình cho phép nhiều epitope tương tác với các kháng thể.
• – Carbohydrate và protein bị glycosyl hóa nhiều sẽ không hấp thu tốt với polystyrene trong phương pháp trực tiếp vì chúng có rất ít khả năng tham gia vào các tương tác kỵ nước. Sử dụng liên kết cộng hóa trị hoặc giảm nồng độ chất tẩy rửa là cách tốt nhất để gắn các protein này (liên kết cộng hóa trị có thể được thực hiện trong sự hiện diện của các chất tẩy rửa như Tween20, Tween80.

https://mindovermetal.org/vi/news/blog-kien-thuc/10-dieu-luu-y-de-xet-nghiem-elisa-thanh-cong-cuc-ki-quan-trong-23.html

Một số sản phẩm ELISA phổ biến mà cty Thiết bị KHKT Thái Binh Dương cung cấp: 
https://mindovermetal.org/vi/shops/group/elisa.htmlXem thêm 10 chú ý quan tâm để có tác dụng nghiên cứu và phân tích ELISA thành công xuất sắc : Một số mẫu sản phẩm ELISA phổ cập mà cty Thiết bị KHKT Thái Binh Dương cung ứng :

CÔNG TY TNHH THIẾT BỊ KHOA HỌC KỸ THUẬT THÁI BÌNH DƯƠNG

	Trụ sở: Tầng 3, Số 382/17-19 Nguyễn Thị Minh Khai, P.5, Q.3, HCM VPGD: Số 28 Đường Số 20, KDC Him Lam, P.Tân Hưng, Q.7, HCM
	Tel: (+84) 28 62 65 46 83		Email: Xem thêm: Viber
	Fax: (+84) 28 62 65 46 93		sales@pacificlab.vn

là phản ứng miễn dịch gồm có tối thiểu một kháng thể bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên đơn cử. Tùy theo loại ELISA mà chính sách có sự đổi khác. Giữa mỗi bước, những đĩa giếng thường được rửa bằng dung dịch tẩy nhẹ để vô hiệu những protein hoặc những kháng thể tự do. ThunderBolt là một ví dụ. Đây là một hệ trọn vẹn tự động hóa, gồm có tổng thể những bước như giải quyết và xử lý mẫu, pha loãng, phân phối, ủ và rửa. ThunderBolt cũng gồm có máy đo và nhìn nhận theo chiêu thức phát quang và trắc quang. Tất cả tiến trình được thực thi bằng ứng dụng điều khiển và tinh chỉnh được phong cách thiết kế riêng .

Source: https://mindovermetal.org
Category: Ứng dụng hay